pH值调节诱导鳄蛇鲻肌球蛋白分子展开/折叠行为的研究

摘要

pH值调节法(pH-shifting)提取鱼蛋白是鱼糜生产新工艺,不仅能提高蛋白得率,在一定程度上还能改善蛋白质的功能特性,但有关其功能特性的改善与结构关系的研究还不够系统深入。为此,本研究以鳄蛇鲻肌球蛋白为研究对象,从广泛pH值条件(2.0-12.0)诱导鳄蛇鲻肌球蛋白去折叠行为入手,分析了极端酸/碱条件下不同酸、碱类型对肌球蛋白去折叠行为的影响,不同盐浓度对酸/碱去折叠肌球蛋白的影响,最后分析了不同酸、碱类型诱导去折叠后两种重折叠途径对肌球蛋白构象影响。本文可为pH值调节法生产鱼糜工艺提供理论依据,对于认识肌球蛋白分子去折叠和重折叠构象变化,开发功能性质良好的水产蛋白具有指导作用。主要结果如下:
　　1、鳄蛇鲻肌球蛋白重链分子量为200 kDa,三种轻链分子量分别为18 kDa、22kDa和26 kDa,蛋白纯度达到了97％,满足后续试验的要求。在等电点处,肌球蛋白的表面疏水性最小。在近中性条件下总巯基含量最高(24.9 mol/105 g和11.3 mol/105 g),酸碱性条件使总巯基含量下降。在等电点 pH范围内,肌球蛋白的表面疏水性、α-螺旋含量均小;极端酸性和碱性条件下表面疏水性与溶解性呈相同趋势,α-螺旋含量则相反。高盐浓度(600 mmol/L KCl)使肌球蛋白的等电点向酸性方向偏移(5.0→4.0)。酸性pH值条件下,低盐浓度下的肌球蛋白表面疏水性高于高盐浓度;碱性pH值条件下,出现相反的结果。碱性条件更容易产生多聚体,并且多聚体主要由肌球蛋白分子的重链通过二硫键交联产生。
　　2、对于强酸,诱导肌球蛋白疏水性大小顺序为盐酸(HA)~硫酸(SA)>磷酸(PA);对于弱酸,其顺序为柠檬酸(CA)>乳酸(LA)>醋酸(AA)。不同类型的酸对色氨酸荧光影响规律变化不明显。LA处理的肌球蛋白α-螺旋含量最低,其它各酸处理之间差异不明显。pH=2.0时,三种有机酸(醋酸、乳酸和柠檬酸)处理的肌球蛋白总巯基含量低于三种强酸。酸的种类对肌球蛋白结构的影响与pH值有关。碱性条件下,随着pH值的增大,肌球蛋白表面疏水性和色氨酸荧光呈相反趋势。氨水处理组表面疏水性较KOH与NaOH处理组低,α-螺旋含量及色氨酸荧光较KOH与NaOH处理组高。KOH与NaOH处理对表面疏水性、色氨酸荧光、α-螺旋含量及总巯基含量的影响差异不明显。NaOH及KOH对肌球蛋白结构的影响不明显。氨水使肌球蛋白变性程度最小。
　　3、在KCl浓度为0.4-0.6 mol/L范围内,三种pH值条件下的肌球蛋白的溶解性均大于91.6%。KCl浓度大于0.6 mol/L时,三种pH值条件下肌球蛋白溶解性均出现下降,其中中性及碱性条件下下降缓慢,酸性条件下几乎不溶。在0-0.04 mol/L KCl范围内,极端酸、碱性条件下肌球蛋白表面疏水性值大于中性(p<0.05);在盐浓度>0.6 mol/L时,碱性及中性条件下,肌球蛋白表面疏水性均随盐浓度增加而增加,且碱性条件下表面疏水性小于中性。在pH值为2.0时,随着盐浓度增加总巯基含量有缓慢下降的趋势。盐浓度>0.6 mol/L时,中性条件下总巯基含量出现了下降,碱性条件则缓慢上升。电泳分析表明,碱性条件下盐浓度的增加(0-0.6 mol/L)促进了肌球蛋白大分子聚合物的形成。中性条件下,α-螺旋含量在0-0.2 mol/L KCl含量较低;中性及碱性条件下,盐浓度>0.6 mol/L时α-螺旋含量随盐浓度增加而升高。微量DSC分析表明,各条件下肌球蛋白吸热曲线在30-60 oC之间出现了两个吸收峰,盐浓度提高增加了第一转变温度。酸性条件下,盐浓度的升高降低肌球蛋白的展开;中性及碱性条件盐浓度(>0.6 M)的升高促进肌球蛋白的展开。
　　4、不同种类酸、碱诱导的展开-重折叠展肌球蛋白,其表面疏水性高于对照,色氨酸荧光强度、总巯基含量和α-螺旋含量均低于对照(p<0.05);碱性处理的肌球蛋白表面疏水性和α-螺旋含量高于酸性处理组,色氨酸荧光强度低于酸性组,总巯基含量与酸性处理组差异不明显(p>0.05)。柠檬酸处理组肌球蛋白的表面疏水性和α-螺旋含量高于盐酸处理组,色氨酸荧光低于盐酸处理组,总巯基含量与盐酸处理组差异不明显;酸性诱导展开处理,IP重折叠处理组肌球蛋白的表面疏水性、总巯基含量和α-螺旋含量高于NP组,但色氨酸荧光强度差异不明显。碱处理诱导肌球蛋白展开-重折叠构象与碱类型、pH值及重折叠途径都密切相关。各pH值条件下,NaOH处理组的肌球蛋白色氨酸荧光强度高于KOH组,但α-螺旋含量低于KOH处理组。IP重折叠过程比NP处理具有更高疏水性值,更低的α-螺旋含量,但色氨酸荧光及总巯基含量差异不明显。重折叠后的肌球蛋白热变性温度均低于对照;酸处理组肌球蛋白第一转变温度与碱处理没有明显差别,但第二转变温度稍高于碱处理组(p>0.05)。同pH值条件下,IP重折叠处理的肌球蛋白比NP重折叠处理具有更高的热转变温度。

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1 绪论

1.1 鳄蛇鲻

1.2 肌球蛋白的结构和性质

1.3 pH值调节对肌球蛋白结构和溶解性的影响

1.4 本研究的立题依据和研究内容

2 pH值对鳄蛇鲻肌球蛋白分子去折叠行为的影响

2.1 引言

2.2 材料与设备

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 本章小结

3 不同种类的酸/碱诱导鳄蛇鲻肌球蛋白去折叠行为的探讨

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 实验方法

3.4 结果与分析

3.5 本章小结

4 盐浓度对鳄蛇鲻肌球蛋白酸/碱去折叠行为的影响

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 实验方法

4.4 结果与分析

4.5 本章小结

5 pH值调节诱导酸/碱变性肌球蛋白重折叠行为的影响

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 实验方法

5.4 结果与分析

5.4 本章小结

6 结论与展望

6.1 研究结论

6.2 研究创新点

6.3 研究展望

参考文献

附录

致谢

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