卵黄高磷蛋白磷酸肽制备及体外抗炎作用的研究

摘要

卵黄高磷蛋白磷酸肽(phosvitin phosphopeptide，PPPs)具有抗菌、抗氧化和促钙吸收等功能，并具有潜在的抗炎作用。本研究探讨了以鸡为原料制备卵黄高磷蛋白及其磷酸肽的工艺条件，并在细胞水平上研究分析了PPPs的体外抗炎作用。
　　 首先，确定了蛋黄卵黄高磷蛋白(PVs)粗制品经阴离子交换树脂QSFF纯化的最佳工艺条件:平衡缓冲液为NaAc/HAc缓冲液(20 mmol/L、pH5.0)，以含0.3、0.5、0.6 mol/L NaCl的NaAc/HAc缓冲液分步洗脱;所得蛋白的N/P摩尔比为2.78，回收率57.6％，蛋白质含量85.66％，纯度95.43％，且PVs含有β-PVs、α1-PVs和α2-PVs三种组分，分子量分别为44.4 Ku、37.5 Ku和42.0 Ku，相对含量分别为67.95％、4.17％和23.30％。
　　 然后，以酶解水解度(DH)以及酶解产物抑制RAW264.7细胞产生NO量的抑制率(IA)为效应值，通过单因素试验以及响应面法确定酶解PVs制备PPPs的工艺条件。其中:单因素试验确定了底物浓度2％，酶解时间3h，选定了NaOH预处理浓度、pH和温度作为响应面法进一步优化的因素，同时也证明了在适当作用时间内控制碱预处理PVs时NaOH浓度可以控制PVs脱磷率，而不同脱磷率的PVs的酶解产物抑制RAW264.7细胞产生NO量的抑制率具有不同的性能;响应面法中通过中心复合旋转回归模型优化了NaOH预处理浓度、pH值以及酶解温度这三个因素的值分别为0.26 mol/L、8.12、40.39℃;此条件下酶解产物PPPs对LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生的抑制率(IA)为61.25％;终产物PPPs灰分含量2.03％，水分含量1.50％，N/P为11.97。
　　 最后，在细胞水平上研究了PPPs抗炎作用，采用LPS刺激Caco-2和RAW264.7细胞建立炎症模型，测定PPPs对TNF-α、IL-6、IL-8的分泌量和NO合成量的影响。PPPs可显著抑制NO的合成且具有剂量依赖作用，且对RAW264.7细胞的抑制作用高于Caco-2，如:PPPs浓度为1000μg/ml时，对RAW264.7细胞产生NO的抑制率为70％，而对Caco-2细胞抑制率仅为47％; PPPs可抑制LPS诱导的TNF-α的分泌，PPPs浓度为1000μg/ml时抑制效果最好，呈现剂量依赖性;PPPs可显著抑制RAW264.7细胞IL-6的分泌，在0.1-100μg/ml的浓度范围内对IL-6分泌的抑制作用呈现剂量依赖性;PPPs浓度高于10μg/ml时可显著抑制Caco-2细胞IL-8的分泌，且在10-1000μg/ml的浓度范围内，PPPs抑制Caco-2细胞分泌IL-8的作用呈剂量依赖性。结果表明PPPs通过下调Caco-2和RAW264.7炎症因子的表达水平发挥体外抗炎作用。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1.1 卵黄高磷蛋白及其磷酸肽的研究现状

1.1.1 卵黄高磷蛋白的组成和结构

1.1.2 卵黄高磷蛋白及磷酸肽的制备纯化

1.1.3 卵黄高磷蛋白及磷酸肽的抑制／促进金属离子吸收作用

1.1.4 卵黄高磷蛋白及磷酸肽的抗氧化作用

1.1.5 卵黄高磷蛋白及磷酸肽的乳化作用

1.1.6 卵黄高磷蛋白及磷酸肽的抗菌作用

1.2 酪蛋白磷酸肽免疫调节功能研究进展

1.2.1 CPP的体外免疫调节功能

1.2.2 CPP的体内免疫调节功能

1.3 评价天然抗炎物质所应用的细胞株

1.3.1 结肠上皮细胞

1.3.2 单核巨噬细胞

1.4 课题研究的目的及意义

1.5 本课题研究的主要内容和技术路线

第二章 卵黄高磷蛋白的纯化

2.1 引言

2.2 实验试剂及仪器

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 卵黄高磷蛋白粗品提取工艺

2.3.2 阴离子交换层析纯化工艺条件的研究

2.4 主要参数及检测方法

2.4.1 凝胶电泳分析(SDS-PAGE)

2.4.2 N／P摩尔比的测定

2.4.3 卵黄高磷蛋白分子量测定及纯度分析

2.4.4 卵黄高磷蛋白回收率计算

2.5 结果与分析

2.5.1 两种洗脱方式对QSFF阴离子交换层析的影响

2.5.2 QSFF阴离子交换层析结果

2.6 本章小结

第三章 响应面法优化酶解制备卵黄高磷蛋白磷酸肽工艺

3.1 引言

3.2 实验试剂及仪器

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 卵黄高磷蛋白的碱预处理

3.3.2 卵黄高磷蛋白磷酸肽对RAW264.7细胞的毒性作用

3.3.3 酶解工艺指标的测定方法

3.3.4 响应面法优化酶解卵黄高磷蛋白制备PPPs工艺条件

3.3.5 卵黄高磷蛋白磷酸肽产品分析

3.4 结果与分析

3.4.1 碱预处理结果分析

3.4.2 卵黄高磷蛋白磷酸肽对RAW264.7细胞的毒性作用

3.4.3 胰酶水解单因素条件的确定

3.4.4 CCRD实验结果分析与讨论

3.4.5 卵黄高磷蛋白磷酸肽产品结果

3.5 讨论

3.6 本章小结

第四章 卵黄高磷蛋白磷酸肽体外抗炎作用的研究

4.1 引言

4.2 实验试剂及仪器

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 细胞培养

4.3.2 细胞存活力的测定

4.3.3 炎症因子NO的测定

4.3.4 细胞因子的测定

4.3.5 数据分析

4.4 结果与分析

4.4.1 卵黄高磷蛋白磷酸肽对细胞的存活力的影响

4.4.2 卵黄高磷蛋白磷酸肽对Caco-2细胞炎症因子的影响

4.4.3 卵黄高磷蛋白磷酸肽对RAW264.7细胞炎症因子的影响

4.5 讨论

4.6 本章小结

第五章 总结与展望

参考文献

发表论文及参加科研情况说明

致谢