蜜蜂、家蚕ADAR基因克隆和在毕赤酵母中表达研究及昆虫钠离子通道基因克隆、选择性剪切及RNA编辑分析

摘要

真核生物前体RNA需要经过一系列的转录后加工才能形成成熟的mRNA,这些加工过程包括选择性剪接、RNA编辑以及RNA 3'端多聚腺苷酸化等过程。其中有一种RNA编辑作用是由腺嘌呤脱氨酶(ADARs)介导的,被称为A至I RNA编辑。ADARs是一种RNA编辑酶,作用于双链RNA(dsRNA)上的腺嘌呤,通过水解脱氨作用使腺嘌呤转变为次黄嘌呤。像其它双链RNA结合蛋白一样,ADARs可以非特异性地结合到双链RNA上,一旦结合到双链RNA后,ADARs可以高效地使特定位点上的腺嘌呤脱氨基。大多数酶将腺嘌呤脱氨产物次黄嘌呤识别成为鸟嘌呤,在翻译过程中次黄嘌呤被当作鸟嘌呤,这样ADAR5就改变了RNA的原始序列信息。此外,由于次黄嘌呤与胞嘧啶配对,ADARs还可把AU碱基转变为IU碱基对,改变RNA的空间结构。 1.蜜蜂、家蚕腺嘌呤脱氨酶的克隆及蜜蜂ADAR基因毕赤酵母表达研究本研究在蜜蜂中克隆到ADAR基因全长序列(AmADAR),并在家蚕中得到部分序列,通过多序列对比分析发现与黑腹果蝇有47.41％相似性,并发现蜜蜂ADAR基因的表达受到选择性剪切的调控,在不同的发育阶段(卵,幼虫、蛹、成虫)表达量也有所差异,具体表现为在成虫中表达量最高,卵中次之,幼虫中表达量较低,蛹中表达量最低,家蚕ADAR在蛹中表达量最高,幼虫中次之,成虫中表达量较低,卵中表达量最低。这些实验结果表明蜜蜂和家蚕ADAR的表达受到严格的调控。 我们构建重组载体在毕赤酵母中表达蜜蜂ADAR基因,采用电转化的方法将重组表达载体pSK-FLIS6-AmADAR转化到感受态的酵母细胞的基因组中,然后采用营养缺陷型的培养基及PCR的方法筛选阳性酵母转化子His+,再利用MM和MD培养基筛选甲醇利用慢型菌落Muts。将His+Muts型转化子接种于BMGY培养基获得生物量的菌体后,再用含0.5％甲醇的BMMY培养基诱导表达,进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot鉴定。结果显示表达蛋白的分子量约为70KD。 2.昆虫钠离子通道基因选择性剪切和RNA编辑研究电压门控钠离子通道是与电兴奋性细胞产生动作电位有关的大跨膜蛋白,在昆虫中钠离子通道基因的转录本受到RNA编辑和选择性剪切调控。在本研究中,我们在蜜蜂,家蚕,赤拟谷盗和果蝇D.ananassae中鉴定到全长钠离子通道基因。在蜜蜂中有10个编辑位点(这些编辑位点均造成氨基酸的变化);在家蚕中有5个编辑位点(其中4个造成氨基酸的变化);在果蝇D.ananassae中有6个编辑位点(其中4个造成氨基酸的变化)。另外,我们发现在蜜蜂钠离子通道基因Am-para中有6个选择性剪切外显子,其中有2个与黑腹果蝇相同；在家蚕钠离子通道基因Bm-para中有9个选择性剪切外显子,其中有8个与黑腹果蝇相同；赤拟谷盗钠离子通道基因Tc-paral中有1个选择性剪切外显子,Tc-para2中有4个选择性剪切外显子；果蝇D.ananassae钠离子通道基因中有10个选择性剪切外显子,其中有10个与黑腹果蝇相同,有一个选择性外显子在果蝇,蜜蜂,赤拟谷盗中均存在。 有趣的是,我们发现在赤拟谷盗中有两个复制基因都编码钠离子通道,以上实验结果表明除RNA编辑和选择性剪切外,昆虫钠离子通道基因可以通过基因复制来达到转录本的多样性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语

声明

致谢

第一章引言

1.1 RNA编辑方式

1.1.1锥虫线粒体RNA多个U的添加和去除

1.1.2 C至U RNA编辑

1.1.3高等生物中的A至I RNA编辑

1.2 ADAR编辑酶研究进展

1.3选择性剪接方式

1.4 钠离子通道研究进展

1.4.1哺乳动物钠离子通道结构

1.4.2昆虫钠离子通道研究现状

第二章实验方案设计

2.1实验目的和意义

2.2研究内容

2.2.1蜜蜂、家蚕腺嘌呤脱氨酶的克隆及蜜蜂ADAR毕赤酵母表达研究

2.2.2昆虫钠离子通道基因选择性剪切和RNA编辑研究

2.3技术路线与实验方案

第三章蜜蜂、家蚕ADAR基因克隆及在毕赤酵母中表达研究

3.1材料与试剂

3.2实验方法

3.2.1目的基因的选择

3.2.1引物的设计与合成

3.2.3蜜蜂、家蚕基因组DNA的提取

3.2.4提取蜜蜂、家蚕四个发育阶段的总RNA

3.2.5第一链cDNA的合成

3.2.6 cDNA为模板进行PCR扩增

3.2.7 PCR产物的回收

3.2.8 PCR产物割胶回收

3.2.9 PCR产物直接测序

3.2.10 cDNA扩增产物的T载体连接反应

3.2.11 Ecoli TG1感受态细胞的制备

3.2.12连接产物转化感受态细胞

3.2.13抽提质粒DNA

3.2.14重组质粒酶切鉴定

3.2.15重组质粒的PCR鉴定

3.2.16重组质粒插入片段序列测序

3.2.17阳性克隆载体电转化到毕赤酵母中

3.2.18阳性酵母菌落的筛选与鉴定

3.2.19阳性菌落的诱导表达

3.2.20表达产物的SDS-PAGE凝胶检测

3.2.21 Western-blot检测表达的蛋白

3.2.22酵母表达产物AmADAR纯化

3.3结果与分析

3.3.1 AmADAR和BmADAR基因的克隆及序列分析

3.3.2.AmADAR基因选择性剪切分析

3.3.3AmADAR和BmADAR基因发育阶段表达差异研究

3.3.4AmADAR酵母表达SDS-PAGE分析

3.4讨论

第四章 昆虫钠离子通道基因选择性剪切和RNA编辑研究

4.1材料与方法

4.1.1实验材料和方法

4.1.2引物的设计与合成

4.2结果与分析

4.2.1昆虫钠离子通道基因的克隆及序列分析

4.2.2昆虫钠离子通道基因的选择性剪切分析

4.2.3昆虫钠离子通道基因RNA编辑分析

4.3讨论

参考文献

攻读硕士学位期间参与发表的学术论文

个人简历