手性有机磷农药的稳定性及立体选择性生物行为研究

摘要

我国对5种高毒有机磷农药(organophosphorus pesticides，OPs)的全面禁用将导致国内在农药使用上的巨大空缺，因此急需开发和生产既经济有效，又环境友好的可替代品。OPs在结构上有两个特点：第一，容易因亲核试剂或其他因素而发生变化，保存难度高；第二，有40％都是手性的，而手性OPs的不同旋光异构体的药效、毒性、神经系统干扰和环境归趋等均有可能不同。因此，在新OPs的开发和生态风险评价中，稳定性和手征性问题引起了广泛的关注，是农药化学和环境科学研究的共同热点，已成为一个世界性的研究课题。 本文以两种我国目前推荐使用的高毒农药的替代品——氯胺磷( CP)和蔬果磷为研究对象做了以下几个方面的研究： (1)对CP唯一的商品化制剂——30％氯胺磷乳油(CP EC)的常温贮存过程进行监控，发现其不稳定性并解释相关机制。结果表明，氯胺磷乳油的不稳定性与其助溶剂甲醇有关，引发两个后果：一方面，大部分CP与甲醇通过亲核加成生成一个新的有机磷化合物——甲基氯胺磷( MCP)，此化合物后被证实稳定且高效；另一方面，CP分解生成甲胺磷致使制剂的毒性增加。由此，30％氯胺磷乳油的应用受到很大的限制，我们提出两条解决思路：第一是从外因出发，开发氯胺磷新剂型，使其避免过于极性的环境；第二是从内因出发，以甲基氯胺磷替代氯胺磷。 (2)鉴于环糊精在改善农药稳定性中的应用，本人制备、表征了CP/β-环糊精的包合物，并分别从环糊精对CP的稳定性和毒性效应的影响来论证此包合物作为CP新剂型活性成分的开发前景。结果表明，简单的固相研磨法可制得环糊精与CP的包合物，当CP包结于β-CD后，其热稳定性提高3.6倍，同时环糊精的包合对CP的活性和毒性均未产生明显影响。由此我们认为，与环糊精包合可能是开发氯胺磷新剂型的一条较好的途径，具有一定的应用前景。 (3)旋光纯异构体的分离和制备是研究手性农药立体特异性构效关系和环境行为的首要前提和基本保障。本文借助多糖类商品化手性柱在HPLC上拆分并制备CP、MCP和蔬果磷的旋光异构体标样。结果表明，CP和MCP的四个立体异构体在Chiralpak AD柱上均得到基线分离，结合前人的研究我们进一步发现Chiralpak AD柱对含碳、磷两个不对称中心的OPs的手性拆分具有普遍的适用性。多糖类手性固定相对蔬果磷的手性识别能力很强，Chiralpak AD、Chiralcel OD和Chiralcel OJ三根手性柱均能有效分离蔬果磷的两个对映体，其中Chiralpak AD的分离效果最好，分离度为4.14。由上，本文采用Chiralpak AD柱制备以上三种有机磷化合物的单一旋光异构体，得到的旋光异构体标样的纯度均>98％，可用于生物学实验。 (4)在得到旋光纯异构体标样的基础上，我们进一步研究了以上三种有机磷化合物在不同毒性效应上的立体选择性。 ①实验首先测定了CP外消旋体，各立体异构体(峰1～峰4)及等摩尔对映体混合物(pair1和pair2)的体外乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性及体内大型蚤毒性，均发现了明显的立体选择性。其中，异构间对AChE的抑制活性大小为峰4>峰3>峰2>峰1，差异在1.1～18.1倍之间，对大型蚤的毒性大小为峰4>峰3>峰2>峰1，差异在1.1～21.4之间。进一步的酶抑制动力学研究表明不同异构体对AChE的空间取向和磷酰化性能均不相同。 ②对MCP毒性的立体特异性研究开始关注农药对人体健康的影响，通过在体外模式下对人成神经细胞瘤SH-SY5Y的AChE和轴突生长的抑制的测定，分别评价了MCP对人体的急性和迟发性神经毒性的立体选择性。研究进一步结合MCP在药效上的立体选择性探讨外消旋MCP及其手性富集产品作为农药的可能性和价值。结果表明，外消旋MCP稳定、高效、急性毒性低，但有可能引发迟发性的神经中毒，因此作为农药使用有一定的限制。MCP各旋光异构体的急性毒性都很低，无明显差异，但在杀虫活性和迟发性神经毒性上则具有很明显的立体选择性。峰1、峰2、峰3、峰4的杀虫活性分别为其外消旋体的3.1、0.6、0.5和1.0倍，相应的迟发性神经毒性分别为其外消旋的<0.7、0.7、42.9和9.5倍。由此我们得出，在MCP的四个立体异构体中，峰1是其外消旋体的最佳替代品。若以峰1替代外消旋MCP，农药用量节省2/3，同时人体遭受迟发性神经中毒的风险将下降。此外，峰1和峰3的等摩尔混合物pair1的杀虫活性、急性毒性以及迟发性神经毒性均与峰1相当，从经济和技术上考虑，pair1的开发价值大，应用前景佳，是CP的优良替代品。 ③蔬果磷及其制剂的稳定性已有不少研究，因此我们仅关注其生物行为对映体选择性。本文评价了蔬果磷在体外AChE、丁酰胆碱酯酶(BChE)抑制，体内大型蚤毒性及细胞模式下对人体急、慢性神经毒性的对映体选择性。结果表明，蔬果磷的体外AChE抑制活性和迟发性神经毒性很低，但对体外BChE、细胞AChE的抑制活性以及对大型蚤的毒性则较高，且具有明显的对映体选择性。但总体来讲，蔬果磷在多种毒性作用上的对映体选择性均不强烈，最大差异也小于5倍，目前无手性转化的必要。另外，蔬果磷的两个对映体在多种毒性作用上都表现出明显的拮抗效应，因此由外消旋体得到的毒性数据可能会造成对其生态风险的低估，而且，随着蔬果磷在环境中的对映体选择性降解，其对环境的毒性将会增加。 综合以上，本论文有两个方面的主要成果：一方面，我们对氯胺磷制剂的贮存不稳定性给出了一个可靠而合理的解释，提出解决问题的思路并从内外因上分别给予具体尝试，为氯胺磷今后的使用提供了有效参考。另一方面，通过对氯胺磷、甲基氯胺磷和蔬果磷三个有机磷化合物的手性层面的研究，并结合其它研究者的工作，我们得到对于手性有机磷化合物的生物效应来说，立体选择性可能是个普遍现象。因此，有关手性农药的研究，只有深入到手性层面，才能反映其真实的环境行为学状况，制定出准确的环境政策、法规和标准。此外，化合物靶标药效和非靶标毒性的立体选择性的比较研究对其手性转换价值和可能性的评价也非常有效。

目录

文摘

英文文摘

致谢

1绪论

1.1前言

1.2有机磷农药概述

1.2.1发展历史

1.2.2有机磷农药的分类

1.2.3有机磷农药的多毒性作用机制

1.3有机磷农药的贮存稳定性

1.3.1影响有机磷农药贮存不稳定的因素

1.3.2提高有机磷农药贮存稳定性的一般方法

1.4环糊精在农药稳定性中的应用

1.4.1环糊精的结构和性质

1.4.2环糊精包合物的制备方法

1.4.3环糊精-农药包合的形成条件和稳定因素

1.4.4环糊精对农药的稳定效应

1.5手性有机磷农药研究进展

1.5.1立体化学的基本概念

1.5.2手性有机磷农药的种类

1.5.3手性有机磷农药的分离

1.5.4手性有机磷农药的立体选择性生物行为

1.6本课题的提出及研究内容

第一章参考文献

2氯胺磷的立体选择性分离和毒性

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1主要仪器和试剂

2.2.2色谱条件及立体异构体的鉴定

2.2.3乙酰胆碱酯酶抑制实验

2.2.4急性水生毒性试验

2.3结果与讨论

2.3.1立体异构体的拆分及鉴定

2.3.2 AChE抑制的立体选择性

2.3.3水生毒性的立体选择性

2.4本章小节

第二章参考文献

3氯胺磷乳油在贮存过程中的不稳定性及其机理

3.1前言

3.2实验部分

3.2.1主要仪器和试剂

3.2.2氯胺磷原油和30%氯胺磷乳剂的常温贮存

3.2.3分析纯氯胺磷在甲醇中的热贮存

3.2.4 RM中主产物的分离及鉴定

3.2.5 GC-MS操作条件

3.2.6氯胺磷及各主产物的定量

3.2.7体外乙酰胆碱酯酶抑制实验

3.2.8 30%MCP水乳剂和30%ECCP对小菜蛾及粘虫的室内药效

3.3结果与讨论

3.3.1常温贮存对氯胺磷原油及其30$乳剂的影响

3.3.2 RM中主产物的判定

3.3.3氯胺磷乳油的不稳定机制

3.3.4 MCP和CP杀虫活性的比较

3.4本章小节

第三章参考文献

4氯胺磷/β-环糊精包合物的制备、稳定性及生物效应

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1主要仪器和试剂

4.2.2氯胺磷/β-环糊精包合物的制备

4.2.3氯胺磷的定量

4.2.4氯胺磷在不同浓度环糊精溶液中光谱的测定

4.2.5 DSC参数

4.2.6 FTIR参数

4.2.7 XRD参数

4.2.8热稳定性试验

4.2.9 AChE抑制试验

4.2.10急性水生毒性试验

4.3结果与讨论

4.3.1氯胺磷的包合率

4.3.2紫外光谱法测定结合常数

4.3.3 DSC测试

4.3.4 FTIR测试

4.3.5 XRD测试

4.3.6热稳定性试验

4.3.7包合物的生物效应

4.4本章小节

第四章参考文献

5甲基氯胺磷立体选择性生物效应及手性转化

5.1前言

5.2实验部分

5.2.1主要仪器和试剂

5.2.2 MCP立体异构体的拆分和判定

5.2.3活性测定

5.2.4细胞内急性和迟发性神经毒性实验

5.3结果与讨论

5.3.1立体异构体的拆分及鉴定

5.3.2 MCP药效的立体选择性

5.3.3 MCP在毒性上的立体选择性

5.4本章小节

第五章参考文献

6蔬果磷的对映体选择性分离和毒性

6.1前言

6.2实验部分

6.2.1主要仪器和试剂

6.2.2对映体的分离及鉴定

6.2.3生物学实验

6.3结果与讨论

6.3.1对映体的分离和鉴定

6.3.2对映体选择性毒性

6.4本章小节

第六章参考文献

7研究结果及未来工作展望

7.1研究结果

7.1.1 30%氯胺磷(CP)乳油的贮存不稳定机制

7.1.2 β-环糊精的包合在开发氯胺磷新剂型中的应用

7.1.3三种手性有机磷农药的旋光异构体的拆分及鉴定

7.1.4 CP在AChE抑制和水生毒性上的立体选择性

7.1.5 MCP的立体选择性生物效应及手性转换

7.1.6蔬果磷的对映体选择性毒性效应

7.2未来工作展望

7.2.1氯胺磷热稳定性的研究亟待进一步深入

7.2.2不局限于急性毒性的研究，还应关注长期低剂量的毒性作用

7.2.3总结实验现象，探索内在机制

攻读博士学位期间发表或录用的论文

攻读博士学位期间授权专利

攻读博士学位期间公开专利