中国肝癌病人中四种p53突变体细胞功能的研究

摘要

肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界最高发的恶性肿瘤之一。在我国，肝癌的死亡率居第2位，仅次于肺癌。肿瘤抑制基因p53是研究最为广泛的基因之一，与多种肿瘤的发生密切相关。50％以上的肿瘤中都存在有p53基因的突变。p53是细胞应激的关键性调控因子之一，在发生细胞应急或受损伤的情况时，p53能整合各种不同的细胞危急事件信号，通过转录或非转录途径对这些信号作出包括细胞生长抑制或凋亡在内的不同反应，以阻止遗传信息遭受破坏的细胞进入细胞周期，阻止细胞恶性转化，监视细胞基因组的完整性。因此该基因的突变及失活成为肿瘤研究领域的热点。 前期研究采用PCR扩增产物直接测序的方法，对202例中国肝癌病人的病理组织标本进行p53基因的全程突变检测。在p53基因编码区的11个外显子中，检测出涉及氨基酸改变的25种核苷酸突变。将检测结果与已经报道的中国肝癌中p53基因突变进行比较，本实验所筛查到的25种突变中仅有2种R249S(AGG-AGT，AGG-AGC)和V157F曾经被报道过，其余的22种尚无报道。为探讨p53突变与肝癌发生的关系，本研究根据所筛查到的突变，对在中国肝癌病人中未曾报道过的4种p53突变体C141Y、R156P、C176F、P191S进行细胞功能方面的研究。本研究中，4种突变体的突变率均为0.459％。 首先从人肝cDNA文库中克隆了野生型p53基因，利用定点突变的方法构建了4种真核表达载体pCMV-C141Y、pCMV-R156P、pCMV-C176F、pCMV-P191S，转染p53缺陷型的H1299细胞系。Western Blot检测表明，四种p53突变体在转染量相等的情况下，蛋白表达量相当。双荧光素酶报告基因检测系统对四种突变体的转录活性研究结果表明：同野生型p53相比，C141Y、R156P、C176F对报告质粒pP53-TA-Luc和p21启动子的转录激活能力显著下降，几乎丧失转录激活作用，而P191S对报告质粒pP53-TA-Lue的转录激活能力与同野生型p53相当，对p21启动子的转录激活能力比野生型p53显著增强，相对荧光强度约为野生型p53的2.5倍；流式细胞仪对四种突变体的凋亡检测结果表明：突变体C141Y、R156P、C176的促凋亡能力显著降低，突变体C141Y、R156P的凋亡细胞比例仅相当于野生型p53的1/3，突变体C176F凋亡细胞比例相当于野生型p53的2/3，突变体P191S的促凋亡能力与同野生型p53相当。 本研究表明，4种p53突变体功能差异可能是由于突变本身所致，而不是由于在细胞中蛋白表达水平的差异所引起的。有些突变会使p53作为转录因子的功能丧失，促凋亡能力下降如C141Y、R156P、C176F，而P191S突变对p53的转录活性和促凋亡能力没有显著影响。说明p53突变与肿瘤发生之间的关系除了与突变型p53转录活性及促凋亡能力下降有关外，还存在独立于上述功能的其它模式。本研究首次大规模的对202例中国肝癌病人病理组织标本的p53基因进行全程突变检测，所检测的结果为世界范围内p53基因突变数据库增添了一份详细而有据可查的宝贵资料，丰富了中国肝癌病人的p53基因突变图谱。对四种突变体C141Y、R156P、C176F、P191S的转录活性及促凋亡能力的细胞功能研究，进一步阐明p53基因突变与功能改变之间的关系，加深了对肝癌发生分子机制的认识。为在分子水平上寻找治疗肝癌的新方法提供了科学依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1 p53简介

1.1.1一级结构

1.1.2 p53高级结构

1.2 p53功能研究进展

1.2.1 p53的上游信号网络

1.2.2 p53的下游信号网络

1.3 p53基因突变与肿瘤发生

1.3.1 p53突变的特点

1.3.2 p53突变对其功能的影响

1.3.3基于p53的基因治疗

1.4 p53突变与肝癌的研究进展

1.4.1肝癌中p53突变的特点

1.4.2肝癌中影响p53突变的因素

1.5本研究目的和意义

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1肝脏组织标本

2.1.2 PCR引物

2.1.3细胞株

2.1.4人肝cDNA文库

2.1.5菌株

2.1.6载体

2.2有关分子生物学实验材料及试剂

2.2.1实验材料

2.2.2试剂盒

2.2.3试剂配方

2.3主要仪器设备

2.4国际生物学信息途径和计算机分析软件

2.4.1生物信息途径

2.4.2生物电泳凝胶成像及扫描分析软件

2.4.3核酸分析软件

2.4.4统计分析软件

2.5实验方法

2.5.1肝癌组织总DNA的提取:(按产品说明书进行)

2.5.2 PCR反应体系及条件

2.5.3胶回收

2.5.4 PCR产物纯化

2.5.5 Western blotting

2.5.6 pCMV-p53的构建

2.5.7质粒抽提(按产品说明书进行)

2.6细胞培养

2.6.1细胞复苏

2.6.2细胞的传代培养

2.6.3细胞冻存

2.6.4细胞瞬时转染

2.7双荧光素酶报告反应系统检测荧光素酶活性

2.8细胞凋亡的检测

第三章结果

3.1肝癌组织标本基因组DNA的获取

3.2 p53基因各外显子的PCR扩增

3.3 p53基因突变的测序筛查结果

3.4四种p53突变体的真核表达载体构建

3.5 Western Blot检测

3.6四种突变体对转录活性的影响

3.7四种突变体对细胞凋亡的影响

第四章讨论

4.1中国肝癌病人中p53突变的筛查

4.2四种突变体对细胞功能的影响

4.2.1四种突变体对转录活性的影响

4.2.2四种突变体对细胞凋亡的影响

第五章结论与创新点

5.1结论

5.2创新点

5.3未来工作展望

参考文献

致谢

作者简介