猕猴桃高频再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化;玉米Na/H逆向转运蛋白基因的电子克隆

摘要

本论文的主要研究内容包括两个方面：1.建立了猕猴桃高频再生体系，通过农杆菌转化法将拟南芥Na<,+>/H<,+>逆向转运蛋白基因AtNGX1导入猕猴桃基因组，初步筛选得到转基因植株。2.通过电子克隆方法得到一条玉米Na<'+>/H<,+>逆向转运蛋白的cDNA序列。 一、猕猴桃组织培养和遗传转化 猕猴桃是一种新兴果树，起源于我国，因风味独特，营养价值高，同时具有医疗效果，所以深受人们喜爱。近年来，随着生活水平的提高和消费结构的变化，人们对优质猕猴桃的需求量越来越大。我国猕猴桃种类极其丰富，可以为培育优质猕猴桃新品种提供种质资源，但猕猴桃属植物雌雄异株，遗传背景复杂，传统育种方法存在周期长，效率低等问题。现代生物技术的兴起为猕猴桃育种开辟了一条新的途径，随着猕猴桃组织培养体系的建立，通过遗传转化方法导入抗性基因已成为猕猴桃育种的重要手段。 本实验选用全国栽种面积最大、产量最高的美味猕猴桃作为研究对象，建立了猕猴桃的高频再生体系。在此基础上，采用农杆菌转化法将拟南芥AtNHX1基因转入猕猴桃，并对转化植株做了PCR鉴定。具体工作如下： (1)猕猴桃高频再生体系的建立：实验中以MS培养基为基本培养基，猕猴桃茎及叶片为外植体，研究了2，4-D、6-BA和NAA在美味猕猴桃愈伤组织形成及分化过程中的作用。方差分析表明6-BA可以促进愈伤组织形成，6-BA和NAA配合能明显提高愈伤组织的诱导和分化频率，而2，4-D对愈伤组织形成有抑制作用。附加2mg/L 6-BA、1mg/L NAA和600mg/L水解酪蛋白的MS培养基是愈伤组织诱导和分化的最佳培养基。在该培养基上，以再生的无菌苗为起始材料，一个月后叶盘的再生频率达到100％，每个叶盘平均产生9.33个再牛芽，其中23.21％的芽高度超过0.5cm。附加0.4mg/L IBA的1/2MS培养基为最佳的生根培养基，在该培养基上猕猴桃再生植株生根最多，且形成的愈伤组织最少。 (2)农杆菌介导的猕猴桃遗传转化：用携带pHZX1质粒的农杆菌菌株LBA4404侵染猕猴桃愈伤组织、茎切段和叶圆盘，在附加20mg/L卡那霉素的分化培养基上得到15株抗性再生植株，其中7株在PCR检测时可以扩增产生AtNHX1基因片段。 二、玉米Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白基因的电子克隆 基因的电子克隆是在人类基因组计划和EST发展的基础上，迅速兴起的一种新的基因克隆方法，具有投入少、速度快、技术要求低和针对性强等优点，该方法最初主要用于动物基因的分离，尤其是人类、小鼠和斑马鱼基因等。近年来，随着植物EST数量的迅速增加，通过电予克隆技术也已经分离了很多植物基因。 本工作以水稻Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白基因序列作为查询探针，检索玉米EST数据库，经拼接最终得到一个长度为2055kb的cDNA序列，包含完整的OFR，编码539个氨基酸，与芦苇、獐茅、水稻和大麦的Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白的氨基酸序列相似性大于90％。RT-PCR验证工作正在进行之中。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章猕猴桃高频再生体系的建立及农杆菌介导的遗传转化

一、文献综述

1猕猴桃的组织培养

2猕猴桃遗传转化研究进展

3 Na+/H+逆向转运蛋白与植物的抗盐性

4选题的目的和意义

二、实验部分

1实验仪器

2材料与方法

3结果分析

3.1愈伤组织和芽的诱导

3.2无菌苗直接再生从生芽

3.3植物生长物质对生根的影响

3.4猕猴桃对卡那霉素的敏感性试验

3.5转化植株的PCR结果

4讨论

第二章玉米Na+/H+逆向转运蛋白基因的电子克隆

一、文献综述

1基因的电子克隆

2电子克隆中的一些常见问题和对策

3电子克隆技术的展望

4选题的目的和意义

二、实验部分

1实验材料

2 ZmNHX基因的电子拼接与分析

3玉米总RNA的提取及RT-PCR

4结果分析

5讨论

附图

参考文献

致谢

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