匍匐翦股颖离体再生体系的建立与遗传转化研究;匍匐翦股颖Na/H反向转运蛋白基因的克隆

摘要

随着人们对生活环境的日益关注，草坪业作为一种新兴产业已悄然兴起。草坪可以绿化环境，净化空气，保持水土，降低噪音污染，与人类文明有着非常重要的联系，已成为人们日常生活中不可或缺的部分。始于20世纪70年代的植物基因工程技术已被广泛用于包括草坪草在内的植物的品种改良研究，是当前最有效的育种方法之一。导入其他物种的基因能够拓展遗传改良的范围，有助于解决一些常规育种难以解决的特殊问题。将功能基因有目的、有针对性地导入草坪草胚性愈伤组织，可以经过再生获得改良的转基因植株，这是提高草坪草抗逆性的有途径，已经成为目前研究的热点。 土地盐渍化是限制农作物生长、发育和产量最严重的非生物胁迫因素之一，育耐盐的作物品种是克服这类因素的一条重要途径。国内外学者已就盐分对植物的伤害、植物的耐盐机理进行了长期研究，克隆了一些耐盐相关基因。通过基因工程技术转移这些抗盐基因，已经获得了一批盐胁迫耐受能力提高的转基因植物。 匍匐翦股颖为多年生禾本科翦股颖属植物，原产于欧亚大陆，是最抗寒的冷季型草坪草之一。由于它具有较好的抗淹性，并有出苗均匀、叶片细密等优点，己被世界各国广泛用于建植高档观赏型草坪和运动型草坪，如城市中心广场、高尔夫球场和保龄球场等。但由于生态条件的差异，有些引进品种在我国许多地区表现出一些不尽人意的方面，因此有必要对匍匐翦股颖品种进行抗性改良。 1.再生体系和遗传转化研究 胚性愈伤组织是遗传工程最理想、最常用的受体之一，再生能力很强。目前已对许多禾本科草坪草的不同外植体进行了离体再生研究，但有关匍匐翦股颖蟒蛇(Viper)、潘娜4号(Penn-A-4)和普特(Putter)这3个品种的离体再生体系研究还未见有报道。本工作尝试从胚性愈伤组织诱导和植株再生两个方面对蟒蛇(Viper)、潘娜4号(Penn-A-4)和普特(Putter)3个匍匐翦股颖新品种进行胚性愈伤组织诱导、体细胞胚发生及植株再生研究，旨在为进一步利用现代遗传工程技术改良匍匐翦股颖品质、培育新品种提供实验基础。本研究利用成熟种子作为外植体，分析了2,4-D对匍匐翦股颖胚性愈伤组织诱导与植株再生的影响，并对体细胞胚的发生过程进行了观察。实验结果表明，附加2.0mg/L 2,4-D、0.1mg/L 6-BA时胚性愈伤组织的诱导频率最高。随着2,4-D浓度的增加，愈伤组织的诱导和分化能力明显下降。在再生过程中采用1.0 mg/L的6-BA达到了比较好的效果，大部分实验中愈伤组织的再生频率达到90％以上。同时发现适当提高肌醇浓度可以使苗长得较为粗壮。在实验中还对匍匐翦股颖的体细胞胚发生过程进行了观察，发现匍匐翦股颖的体细胞胚发生要经历球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚等不同阶段。 分别以0.6mol/L和0.4mol/L甘露醇高渗处理5小时和12个小时的匍匐翦股颖胚性愈伤组织为目标材料，利用PDS1000He基因枪和根癌农杆菌LBA4404菌株进行遗传转化，目的基因为Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白基因AtNHX1。所用质粒pHZX1由pBl121改造而来，克隆有拟南芥Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白基因AtNHX1和选择标记基因npt Ⅱ，上游为CaMV35S启动子，下游为NOS终止子。将转化过的胚性愈伤组织转至附加100mg/L硫酸卡那霉素的培养基上进行分化，分别获得6株(基因枪法)和3株(农杆菌法)绿苗。对获得的绿苗进行PCR检测，发现分别有一株(基因枪法)和两株(农杆菌法)绿苗可以扩增出相应条带，初步鉴定为转基因植株。 2.Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白基因序列的克隆与分析 Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白与植物的耐盐性有密切的关系。在高等植物体内，液泡膜Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白主要负责把Na<'+>区隔化至液泡中。植物的Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白基因具有很高的保守性，根据已经报道的液泡膜Na<'+>+/H<'+>反向转运蛋白基因的保守序列设计简并引物，可以从其它物种中分离同源基因。本工作首先提取翦股颖总RNA并反转录合成cDNA第一链，然后采用简并引物通过梯度PCR技术扩增出匍匐翦股颖液泡膜Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白cDNA的中间序列，大小约300bp。中间序列经克隆、测序和Blast同源比对，发现与已知的液泡膜Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白基因序列有很高的同源性，氨基酸序列的一致性最高达到88％，初步确定该序列为匍匐翦股颖液泡膜Na<'+>/H<'+>反向转运蛋白基因的中间片段。 进一步拟根据所获得的序列设计特异性引物，利用3’-RACE和5'-RACE得到cDNA全长序列，然后对其进行表达分析和功能验证。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分.匍匐翦股颖离体再生体系的建立与遗传转化研究

Ⅰ.文献综述

Ⅱ.材料与方法

1.几种匍匐翦股颖成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生

2.几种匍匐翦股颖的遗传转化研究

3.基因枪法介导的遗传转化

4.农杆菌介导的遗传转化

Ⅲ.结果与分析

1.几种匍匐翦股颖离体再生体系的建立

2.利用基因枪法将Na+/H+反向转运蛋白基因导入匍匐翦股颖

3.农杆菌介导的Na+/H+反向转运蛋白基因导入匍匐翦股颖中的研究

Ⅳ讨论

1.几种匍匐翦股颖离体再生体系的建立

2.匍匐翦股颖遗传转化研究

参考文献

第二部分匍匐翦股颖Na+/H+反向转运蛋白基因的克隆与序列分析

1.文献综述

2材料与方法

2.1材料

2.2植物材料培养与处理

2.3实验方法

3结果与分析

3.1简并引物的设计

3.2翦股颖总RNA的提取

3.3 PCR扩增结果

3.4阳性克隆鉴定

3.5测序结果及序列分析

4讨论

4.1翦股颖总RNA的提取

4.2阳性克隆的检测

4.3测序原理与结果

4.4小结

4.5后续实验设计

参考文献

图版说明及图版

致谢