益生菌制剂调节人体肠道菌群的功能性评价

摘要

近年，很多研究表明肠道菌群与宿主的健康状况息息相关，肠道菌群密切影响着宿主的营养吸收、物质代谢、刺激免疫以及胃肠道发育等各个方面。在肠道菌群与宿主相互作用的过程中，宿主自身条件以及如地域、饮食习惯等环境因素共同影响着肠道菌群的形成及多样性组成。同样，肠道菌群的结构组成的变化也会影响宿主状况的改变。国内外的大多数实验很少去评价比较益生菌、益生元以及合生元单一或者复合益生菌制剂对肠道菌群的影响。根据便秘和腹泻志愿者对自己的感受和身体状况作为依据进行不同益生菌制剂的干预6周，期间采集新鲜粪便样品，应用Ion torrent PGM二代测序技术进行16Sr RNA V3区扩增子测序，以及用气相色谱对粪便中的短链脂肪酸(SCFAs)检测。将得到数据进行多样性分析，联合多变量统计学分析方法，从宏观和微观上分析和鉴定三种益生菌制剂对健康、便秘和腹泻人群肠道菌群结构的调节作用的能力。
　　目前大量的研究揭示肠道菌群结构多样性处于较低的状态下可能会引发肥胖、胰岛素抵抗、炎性肠道疾病等许多疾病。研究中多样性的稀疏曲线、Shannon多样性指数、Simpson's指数、Chao1等多样性指数的变化均反应了随着益生菌制剂服用，志愿人群的肠道菌群的群落结构多样性明显增加。
　　测序结果中绝大多数序列属于Bacteroidetes和Firmicutes，约占总序列数的94.37％，肠道中相应的细菌的增长减少都与益生菌制剂的成分相关。在比对水苏糖组、纯菌粉组和MF13组受试人群的肠道菌群中，肠道中与产SCFAs相关的菌属都有明显的增长，如Lachnospiraceae科中的Blautia、Lachnospira以及Ruminococcaceae科中的Faecalibacterium、Oscillospir等，其中Blautia和Faeealibacterium与SCFAs含量呈显著正相关。服用纯菌粉的志愿人群肠道中的产SCFAs相关的菌属的相对丰度要比服用水苏糖和MF13的高。研究还发现服用MF13后，Bifidobacterium、Lactobacillus、Butyricimonas、Parabacteroides这些常见的外源性益生菌都在受试者肠道菌群有明显的增长，而服用水苏糖和纯菌粉的则没有这么明显。在受试人群的肠道粪便菌群中可能致病菌被检测出，随着服用益生菌制剂时间的延长，其相对丰度降低了。健康对照组样品都会与服用益生菌制剂的有交叠的趋势，说明相比较其他因素，服用益生菌制剂调节肠道菌群的菌群结构影响更大。根据肠型的分析，Bacteroides和Prevotella与饮食的调整共同驱动下会改变enterotype，仅通过所选择的益生菌制剂的作用，造成肠型改变不显著。
　　肠道中SCFAs产生菌以及其代谢产生的SCFAs对宿主肠道菌群平衡的维护有重要作用。水苏糖给肠道菌群提供发酵底物，产SCFAs菌属能快速而且大量增长，也不会随着外源性益生元的消失快速死亡，肠道中丙酸含量显著增加，乙酸与丁酸也在2周左右有所增加，随着服用时间延长尤其是停止服用后，SCFAs的含量较干预前都有所增加。服用纯菌粉组的志愿人群不管是便秘还是腹泻的状态，只有乙酸的含量有所增加，丙酸和丁酸甚至呈现降低的现象，而产SCFAs的相关菌属增长较快。志愿人群在服用MF13后，乙酸和丁酸含量都在明显增加，而且停止服用后，SCFAs的含量与正常对照组也没有显著差异。
　　综上所述，益生菌制剂持续的抑制肠道有害细菌的生长，促进有益菌的增殖来维持肠道菌群结构的稳态，如富集产SCFAs菌进行代谢，将疾病状态的肠道菌群结构向正常人群的调节。即使停止服用益生菌制剂后，肠道菌群的群落结构多样性也有所改善。复合的益生菌制剂要比单一的益生元或益生菌可以更好、更快的调节肠道菌群。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 课题研究背景

1．1．1 肠道菌群与人体健康

1．1．2 影响肠道菌群结构的因素

1．1．3 益生菌制剂的研究现状及应用

1．1．4 研究肠道菌群以及代谢产物的技术

1．1．5 多变量统计分析方法在检测肠道菌群的应用

1．2 课题研究的依据及意义

1．3 课题的研究路线

第二章 正文

2．1 研究材料

2．1．1 益生菌制剂来源

2．1．2 志愿者招募

2．1．3 试验试剂

2．1．4 研究仪器

2．2 志愿者的分组以及样品安排

2．3 高通量测序技术探究益生菌制剂调节人群肠道菌群结构

2．3．1 粪便中微生物总DNA的提取

2．3．2 肠道菌群16SrRNAV3 区的 PCR 扩增

2．3．3 测序数据生物信息学和多变量统计学分析

2．3．4 气相色谱分析短链脂肪酸

2．4 研究结果

2．4．1 肠道菌群16S rRNAV3区测序文库的检测

2．4．2 α 多样性分析

2．4．3 肠道菌群中不同分类水平相对丰度的分析

2．4．4 益生菌制剂对肠道菌群整体结构的影响

2．4．5 肠道菌群结构差异显著相关的肠道关键菌属鉴定

2．5 益生菌制剂调节人类肠道菌群代谢SCFAs的影响

2．6 讨论

2．6．1益生菌制剂对志愿人群肠道菌群的群落结构多样性影响

2．6．2 益生菌制剂对志愿人群肠道菌群结构不同进化水平的影响

2．6．3 益生菌制剂对志愿人群肠道菌群整体结构以及关键菌属的影响

2．6．4 益生菌制剂对志愿人群肠道中短链脂肪酸含量的影响

第三章 总结与展望

3．1 研究结论

3．2 研究创新点

3．3 研究展望

参考文献

发表论文、参加科研情况说明

附录

致谢