猪链球菌主要毒力基因的多重PCR检测及其核糖体基因多态性研究

摘要

猪链球菌(Streptococcussuis，SS)是危害现代养猪业的一种重要人兽共患病病原，该菌血清型多、抗原结构复杂，在临床上可呈现不同的特征，如败血症、脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎等，还常常与其他疾病合并感染，发病率和死亡率较高。由于目前对猪链球菌病的发生规律、病原特性以及防治措施还不是十分清楚，单纯靠药物又不能有效地控制该病的发生和蔓延。本研究在对山东地区分离的猪链球菌菌株进行培养、鉴定基础上，建立PCR方法进行血清分型和毒力基因检测，并应用核糖体基因探针杂交方法对部分地区的分离株进行基因分型，以便为该病的免疫防治提供理论依据。本课题分为三个部分进行研究。 1.山东省致病性猪链球菌血清型及耐药性状况调查通过革兰氏染色镜检、生化试验、药敏试验及PCR分型鉴定，对临床分离的猪源链球菌进行血清型和分子流行病学的初步研究。从山东省不同地区的发病猪分离到的20株猪源链球菌，其形态、染色、培养特征及理化特性均符合猪链球菌的特点，采用猪链球菌特异性鉴别引物分别进行PCR扩增，确认9株为猪链球菌，经PCR分型，其中4株鉴定为1型菌株，没有2、7、9型的菌株，其余未定型。药敏试验结果显示，山东地区猪链球菌仅对氨苄西林、阿米卡星、头孢噻肟、头孢唑啉敏感，而对其他常规药物已产生了不同程度的耐药性。 2.猪链球菌三种主要毒力基因的多重PCR检测根据猪链球菌三种主要毒力因子Sly，MRP，EF的基因序列设计和合成了3对特异性引物，通过体系和反应条件优化，建立多重PCR检测方法，对实验室保存的16株背景明确的猪链球菌进行检测，结果显示S1y检出率为4/16，MRP检出率为2/16，EF检出率为0，阳性、阴性对照均成立。分析结果表明该多重PCR检测方法，特异性和敏感性较好，可用于快速诊断以及猪链球菌相关毒力因子的分子流行病学调查。 3.猪链球菌核糖体基因多态性的研究为探讨猪链球菌株的分子流行病学特征以及菌株间的相互关系，对山东和河南地区2003-2006年间分离的20株猪链球菌进行核糖体基因多态性的研究。猪链球菌基因组DNA用限制性内切酶BamHⅠ和BglⅡ双酶切，经Southern迹，然后与一个长度为1493bp的16srRNA基因探针进行杂交，分析杂交图谱。结果显示20株猪链球菌呈现5个核糖体基因型(A-E型)，其中A、B两型占70％，B型为山东地区的优势克隆群。经分析发现，相同临床表型猪链球菌的核糖体基因型是多样的，而该方法所区分的基因型与分离菌株地区来源具有一定的相关性。

目录

文摘

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引言

1猪链球菌及其毒力因子的研究进展

1.1病原学研究

1.2流行病学研究

1.3猪链球菌毒力因子的研究

2细菌分型技术及其在猪链球菌中的应用

2.1根据细菌的溶血能力进行分型

2.2根据菌体荚膜多糖抗原特性差异进行分型

2.3常规血清学分群

2.4基因分型

实验一 山东省致病性猪链球菌血清型及耐药性状况调查

1材料

2方法

2.1病原菌的培养

2.2生化反应鉴定

2.3猪链球菌的PCR鉴定和分型

2.4药敏试验

3结果

3.1猪源链球菌的培养性状和生化鉴定

3.2猪链球菌种属的特异性PCR鉴定

3.3猪链球菌血清型的PCR鉴定

3.4药敏试验结果

4讨论

实验二猪链球菌三种主要毒力基因的多重PCR检测

1材料

2方法

2.1病原菌的培养

2.2 PCR模板的制备

2.3多重PCR方法的建立和优化

2.4敏感性实验

2.5特异性实验

3结果

3.1检测猪链球菌毒力因子基因的PCR方法的建立和优化

3.2多重PCR检测结果

3.3毒力因子基因多重PCR检测的特异性验证

3.4敏感性试验

4讨论

实验三20株猪链球菌核糖体基因多态性的研究

1材料

2方法

2.1菌株基因组DNA的提取和限制性内切酶消化

2.2 PCR扩增及探针制备

2.3探针的标记

2.4 Southern杂交膜的制备

2.5地高辛标记探针的杂交与显色

3结果

3.1 16srRNA基因探针的扩增

3.2分型结果

3.3不同时期和地区菌株DNA的杂交结果

3.4不同临床表型菌株DNA的杂交结果

4讨论

结论

参考文献

个人简介及攻读学位期间发表论文情况

致谢

附录：地高辛标记探针的杂交与显色步骤