Ⅰ白介素-17调节致糖尿病性T细胞介导的NOD鼠1型糖尿病的发生;Ⅱ长期饮酒减少大鼠睾丸间质细胞PBR和StAR表达

摘要

目的: ①研究逆转录病毒转染BDC T细胞能否稳定的表达和分泌IL-17； ②研究siIL-17能否在BDC T细胞的基因表达中抑制IL-17基因的表达。 ③观察IL-17转基因BDC T细胞体内能否诱导NOD.scid转移性糖尿病的发生，以及siIL-17能否通过BDC T细胞基因表达抑制IL-17的表达和体内抑制糖尿病的发生。④研究IL-17对1型糖尿病发病影响的机理。 研究方法: 1、IL-17和siIL-17的病毒载体的构建： 借助于MSCV-IRES-Thy1.1逆转录病毒载体，通过基因重组的方法携带IL-17基因；以Thy1.1作为病毒载体上的目的基因的检验标志；以携带抗凋亡基因Bcl2的重组MIT和空载体MIT为阳性对照；以空白转导作为阴性对照。 以pMND-BANSHEE逆转录病毒为载体，插入U6增强子和Thy1.1实验标志，构成了完整的逆转录病毒载体。siIL-17插入其多克隆位点，构建了siIL-17逆转录病毒载体。 2、Phoenix细胞生产病毒颗粒： Phoenix细胞培养和传代至对数生长期，在钙.磷转导试剂的作用下，加入目的病毒DNA，转染包装细胞，培养24小时即可收获携带目的基因的病毒上清。转染前后使用Thy1.1抗体和流式细胞仪鉴定Phoenix细胞。 3、BDC T细胞的活化： 以anti-mouse CD3和anti-mouse CD28体外共刺激脾细胞约24小时后，通过标记CD4和Vβ4抗体，流式细胞仪检测BDC T细胞的性质；标记CD69和CD62L抗体鉴定T淋巴细胞的活化率。 4、BDC T细胞的病毒感染和IL-17的表达： 目的病毒感染BDC T淋巴细胞。细胞培养后，流式细胞仪检测Thy1.1和Thy1.2抗体标记的双阳性T细胞的百分率并筛选出。ELISA检测双阳性T细胞培养液IL-17表达，确定转染效果。 5、转基因BDC T细胞的接种及效果： 通过目的病毒感染，大量生产转基因BDC T细胞，以抗体-磁珠筛选的方法，筛选出Thy1.1/Thy1.2双阳性细胞并注射NOD.scid鼠，以注射BDC T细胞和PBS作为阴性对照组，观察动物血糖变化。 6、ELISA方法检测NOD.scid小鼠血浆肿瘤坏死因子-alpha(TNF-α)、干扰素-gamma(IFN-γ)和白细胞介素-6(IL-6)以及白细胞介素-4(IL-4)，并送检胰腺进行病理检查，及流式细胞学检查脾脏和胰腺淋巴结。 结果:1、细胞克隆生产的重组逆转录病毒为分别携带目的基因IL-17和siIL-17的病毒DNA.测序和酶切结果和预期结果完全一致。 2、携带目的基因的病毒载体转染Phoenix包装细胞：抗体标记和流式细胞学鉴定转导Phoenix细胞呈Thy1.1阴性，转导后， MIT空载体、重组Bcl2-MIT质粒、重组IL-17质粒和siIL-17质粒的转导率分别是(96.14±4.2)％，(93.2±2.2)％，(93.5±3.2)％和(89.5±4.7)％，与空白对照组(0.4±0.1)％相比，均有显著性差异(P＜0.01)。 3.BDC T细胞的活化：分别用CD4/CD69和CD4/CD62L抗体标记活化前、后的脾细胞，与活化前比较，活化后BDC T细胞比例增加，活化前、后CD4+/CD69+细胞和CD4+/CD62L-细胞的比例分别由(3.4+1.5)％和(8.6+2.8)％提高至(33.74±6.9)％和(25.54±5.3)％，提示CD4+细胞处于较理想的被转染状态。 4.携带目的基因的逆转录病毒转染活化的T淋巴细胞：在Mock空白对照组、MIT空载体组，Bcl2阳性对照组、IL-17组和siIL-17组中，Thy1.1+/Thy1.2+细胞比例分别为(0.64±0.3)％，(7.2±2.4)％，(6.84±2.6)％，(6.44±2.4)％和(4.6±1.8)％。 5、转基因BDC T细胞的筛选和鉴定：以Thy1.1、Thy1.2和BDC2.5TCR抗体标记被筛选的细胞，并进行流式细胞学分析显示：①经Thy1.25和IBDC2.5TCR抗体标记证实被筛选的细胞是BDC2.5 T细胞，②与筛选前对比，Thy1.1和Thy1.2抗体标记的双阳性IL-17转基因细胞从(5.14±2.4)％提高到(97.2±1.2)％，siRNA-IL-17转基因细胞从(4.64±1.6)％提高到(83.2±6.3)％。 6.转基因NOD/BDC T细胞IL-17的体外表达：IL-17转基因T淋巴细胞的IL-17水平显著升高，活化后可进一步促进IL-17的表达。siIL-17转基因T淋巴细胞可显著抑制IL-17的表达，IL-17的水平显著降低。 7、NOD.scid鼠血糖监测和组织学检查： 至观察期结束，注射IL-17转基因BDC T细胞的NOD.scid小鼠血糖显著升高，全部小鼠均发生糖尿病，而注射siIL-17细胞的NOD.scid小鼠、阴性对照组和BDCT细胞组无一例发病。胰腺组织学H&E染色发现注射IL-17转基因BDC T细胞的NOD.scid小鼠表现为严重的胰岛炎和胰岛结构破坏，模糊不清。而注射silb-17的转基因NOD.scid小鼠和BDC T细胞组多表现为轻、中度胰岛炎，阴性对照组表现为正常胰岛。 8、NOD.scid鼠血浆IL-17、TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-4水平： 注射IL-17BDC T细胞的小鼠血浆IL-17、TNF-α、IFN-γ和IL-6水平均显著高于siIL-17小鼠和对照组(P＜0.01)，而siIL-17小鼠各项血浆细胞因子水平与对照组无显著性差异(P＞0.05)。血浆IL-4水平在IL-17小鼠中未测出，在siIL-17小鼠和对照组中极低。未能检测出NOD.scid小鼠血浆各项细胞因子。 9、流式细胞学结果显示，在IL-17糖尿病发病组，脾脏和胰腺淋巴结BDC T增殖和聚集增多，树突细胞(DC)细胞显著增加。 结论: 1、以逆转录病毒为载体携带IL-17和siIL-17基因转染BDC T细胞，可以体外获得显著高表达的IL-17 BDC T细胞和低表达IL-17 BDC T细胞，而siIL-17基因表达可以有效抑制BDC T细胞中IL-17的表达。 2、Phoenix包装细胞是一个安全有效的逆转录病毒“包装机”。 3、转移高表达IL-17的转基因BDC T淋巴细胞可诱发和加速NOD.scid鼠糖尿病的发生，表达siIL-17的BDC T细胞可通过抑制IL-17的表达抑制NOD.scid鼠糖尿病的发生。 4、IL-17可刺激自身的BDC T活化，导致淋巴细胞胰岛浸润，并通过促进DC活化和BDC T细胞释放TNF-α、IFN-γ、IL-6细胞因子和抑制IL-4细胞因子，最终破坏胰岛D细胞，诱发糖尿病。 5、DC细胞可以通过抗原递呈介导高表达IL-17的BDC T细胞活化增殖和胰岛β细胞损害。 基于上述研究现状，为了更深入的认识乙醇与PBR、StAR的关系和对睾酮的作用机理，本研究确定研究目的与方法如下： 目的: 1、通过对大鼠睾丸组织染色，观察乙醇对大鼠睾丸组织的基本影响； 2、检测大鼠血清睾酮水平，了解乙醇对大鼠血清睾酮的抑制作用： 3、检测乙醇喂养大鼠睾丸StAR mRNA的表达水平；检测睾丸组织PBR和StAR的表达，了解乙醇对PBR和StAR在基因转录和蛋白质水平上的影响； 4、明确PBR和StAR在睾丸组织中的定位，观察定位组织蛋白表达情况。 研究方法: 1、动物模型培养。为检测慢性乙醇对大鼠睾丸组织的影响，Wistar大鼠随机分成四组，每组给予不同剂量的乙醇胃管灌注，每天一次，共20周。麻醉后处死，迅速取睾丸置于液氮保存或4％多聚甲醛中固定、脱水、包埋，制成组织蜡块备用。 2、采用H&E染色，显示睾丸组织的乙醇影响状况。 3、采用罗氏全自动E170电化学发光仪测定大鼠血清睾酮水平。 4、采用RT-PCR检测StAR mRNA水平；采用免疫共沉淀和Western-blot检测PBR和StAR蛋白水平。 5、采用免疫组织化学技术检测PBR和StAR在睾丸组织中的定位和表达水平。 结论: 1、长期慢性乙醇喂养，可降低大鼠血清睾酮的水平。 2、长期乙醇喂养可通过同时抑制大鼠睾丸组织间质细胞的PBR和StAR的表达，抑制睾丸组织睾酮的合成。 3、乙醇可通过抑制睾酮的合成或直接作用等其它途径影响睾丸组织的形态，抑制精子的发育和成熟，使精子数量和质量下降，使生育能力受损。

目录

论文说明：符号说明

声明

摘要

第一部分 白介素-17调节致糖尿病性T细胞介导的NOD鼠1型糖尿病的发生

前 言

实验材料与方法

1.实验动物和细胞珠

2.质粒的构建

3.Phoenix包装细胞（以下简称P细胞）的培养和质粒转导

4.BDC T细胞的活化和病毒转染

5 转基因BDC T细胞的筛选、鉴定与表达

6.转基因BDC T细胞的糖尿病转移实验

7.NOD.scis小鼠胰岛组织学鉴定。

8.流式细胞学分析小鼠脾细胞和胰腺淋巴结细胞：

9.ELISA检测NOD.scid小鼠血清IL-17、TNF-α、INF-γ、IL-6和IL-4水平

结 果

讨 论

结 论

附图一

附图二

参考文献

第二部分 长期饮酒减少大鼠睾丸间质细胞PBR和StAR蛋白表达

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文