α-酮戊二酸脱氢酶基因在嗜酸性氧化硫硫杆菌中的表达研究

摘要

嗜酸性氧化硫硫杆菌广泛用于生物冶金、煤的脱硫和含硫废水及垃圾的处理。酶学分析表明，嗜酸性氧化硫硫杆菌缺乏TCA循环中的关键酶α-酮戊二酸脱氢酶等，不能单纯通过TCA循环氧化碳水化合物获得能量，其不完全的TCA循环仅提供中间产物参与合成细胞的部分碳架。这类细菌的自养生活方式决定了这些细菌生长缓慢、代时长、细胞得率低。这不仅限制了嗜酸性氧化硫硫杆菌在工业上的应用，也给生化检测、蛋白质和酶的分离及DNA的提取等带来困难。要从根本上解决这一问题需要用遗传学的方法对菌种进行改良，使其生长代谢适合于实际应用的要求。 本文的目的是将克隆的异养性大肠杆菌α-酮戊二酸脱氢酶复合体基因sueAB与lpdA导入专性自养极端嗜酸性氧化硫硫杆菌中表达，获得可以表达α-酮戊二酸脱氢酶活性，并能够利用有机质快速生长的嗜酸性氧化硫硫杆菌工程菌，并进一步研究有机质对基因工程菌生长的影响机制以及工程菌对有机质的利用情况等。为改造这类细菌并应用于工农业生产提供理论和方法。 实验室前期已经以E.coli K12菌株基因组DNA作为模板，利用PCR方法扩增得到大肠杆菌α-酮戊二酸脱氢酶复合体sucAB与lpdA全基因序列，并连接到质粒puC18载体中。在此基础上，本文进行了如下研究： 把大肠杆菌α-酮戊二酸脱氢酶复合体sucAB与lpdA基因从pUC18上亚克隆到具有广泛寄主范围的质粒pJRD215上，构建了含大肠杆菌α-酮戊二酸脱氢酶基因的重组质粒pJRD215-sucAB-lpdA。结果表明，重组质粒pJRD215-sucAB-lpdA所携带的sucAB与lpdA基因基因能够在大肠杆菌中表达出具有活性的酶蛋白，而且保留了载体上原有的Km和Sm抗性。 将重组质粒pJRD215-sucAB-lpdA引入整合有tra基因的E.coli SM10中，以E.coli SM10(pJRD215-sucAB-lpdA)作为供体菌，野生型Acidithiobacillus thiooxidans ATCC19377作为受体菌在滤膜上进行接合转移。质粒pJRD215-sucAB-lpdA在tra基因的作用下以较高的频率(2.4×10-6)从大肠杆菌转移到了A.thiooxidans ATCC19377菌株中，并通过质粒提取及菌落PCR进行了验证。酶活性测定表明，在对照野生型菌株的细胞提取液中未检测到α-酮戊二酸脱氢酶活性，而含有重组质粒的嗜酸性氧化硫硫杆菌细胞提取液中可检测到。这表明，大肠杆菌的启动子可以被嗜酸性氧化硫硫杆菌的RaNA聚合酶识别并启动转录，α-酮戊二酸脱氢酶复合体基因能够表达出具有活性的酶，因而推测极端嗜酸性硫杆菌在基因表达机制方面与异养性大肠杆菌可能存在相似之处。利用RT-PCR的方法从转录水平上检测基因的转录，证明野生型嗜酸性氧化硫硫杆菌存在代谢缺陷，而重组菌中可以检测到sucAB与ιpdA基因mRNA的转录。但是无论从蛋白水平还是酶活水平上检测，重组菌中表达的α-酮戊二酸脱氢酶活性非常低，说明在嗜酸性氧化硫硫杆菌和大肠杆菌之间在基因表达和调控方面还存在一定差异。质粒的稳定性测定表明，在无选择压力条件下连续传代50次，质粒在嗜酸性氧化硫硫杆菌的保存率仍可达到71％左右，说明质粒在嗜酸性氧化硫硫杆菌中比较稳定。 研究了氧化硫硫杆菌基因工程菌在Starkey-S0液体培养基中添加不同浓度的葡萄糖、有机酸(α-酮戊二酸、柠檬酸和丙酮酸)的生长状况。结果表明，工程菌可以更有效的利用葡萄糖。而α-酮戊二酸、柠檬酸对野生型与工程菌的生长没有明显影响，这可能与细胞的选择透性有关。研究还发现工程菌可以解除丙酮酸的抑制作用，说明中间代谢产物的积累对细胞确实有毒害作用。虽然葡萄糖对嗜酸性氧化硫硫杆菌的生长有促进作用，但在不提供硫作为能源时无法生长，说明硫杆菌不具备利用有机物产生ATP的电子传递系统，因而对有机物的利用有限。 本文首次将大肠杆菌α-酮戊二酸脱氢酶复合体基因引入嗜酸性氧化硫硫杆菌中，sucAB与ιpdA基因在自身启动子的控制下在宿主菌中获得了表达，证明了异养菌中心代谢途径的酶复合体基因(α-酮戊二酸脱氢酶复合体)能够在专性自养极端嗜酸性氧化硫硫杆菌中表达装配。尽管表达的酶活性较低，所构建的工程菌能够更加有效地利用葡萄糖并消除丙酮酸等中间代谢物的抑制作用，为解决实际应用中菌体生长过慢，效率低的难题提供了一条可能的途径。本研究不仅可以从理论上为揭示细菌自养与异养的关系提供实验依据，而且在应用方面可为构建能够利用有机质快速生长的基因工程菌提供实验指导。

目录

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英文文摘

第一章绪论

1.1硫杆菌的代谢

1.1.1有机物质对专性自养硫杆菌生长的影响

1.1.2自养微生物中心代谢途径

1.1.3硫的代谢

1.2硫杆菌遗传学研究概论

1.2.1硫杆菌质粒的分离

1.2.2硫杆菌基因转移系统的研究

1.3 α-酮戊二酸脱氢酶复合体概况

1.3.1 α-酮戊二酸脱氢酶复合体的组成

1.3.2 α-酮戊二酸脱氢酶复合体的反应机制

1.4本文的研究意义和主要研究内容

第二章携带E.coli α-酮戊二酸脱氢酶复合体基因接合转移型质粒的构建

引言

2.1材料与方法

2.1.1菌株和质粒

2.2培养基和培养条件

2.3结果与讨论

2.3.1构建重组质粒pJRD215-sucAB-lpdA

2.3.2重组质粒pJRD215-sucAB-lpdA的酶切验证

2.3.3重组质粒携带的α-酮戊二酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达

2.3.4大肠杆菌表达的α-酮戊二酸脱氢酶的SDS-PAGE凝胶电泳

本章小结

第三章基因工程菌A.thiooxidans(pJRD215-sucAB-lpdA)的构建

3.1引言

3.2材料与方法

3.3结果与讨论

3.3.1菌体生长条件和生长状态的选定

3.3.2质粒的接合转移

3.3.3重组菌表达产物的鉴定

3.3.4质粒的稳定性

本章小结

第四章嗜酸性氧化硫硫杆菌基因工程菌生长特性的研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1菌株

4.2.2 Starkey-S0有机碳源培养基

4.2.3细菌群体生长量的测定

4.2.4 S042-浓度测定

4.2.5生物量和生长得率的计算

4.3结果与讨论

4.3.1葡萄糖对嗜酸性氧化硫硫杆菌生长的影响

4.3.2有机酸对嗜酸性氧化硫硫杆菌生长的影响

4.3.3嗜酸性氧化硫硫杆菌在无硫培养基上的生长

本章小结

总结

参考文献

致谢