蒙古冰草磷脂酶D基因全长cDNA序列的克隆及生物信息学分析

摘要

本研究以蒙古冰草(Agropyronmongolicumkeng)叶片为材料，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速分离cDNA末端(RACE)技术，克隆得到蒙古冰草磷脂酶D(PLD)基因的全长cDNA序列。然后利用生物信息学软件在线分析其序列结构、氨基酸组成及编码氨基酸的性质和结构，并构建了PLD的进化树。结果表明，该基因cDNA序列全长由2966个碱基组成，包含一个由2439个碱基组成的完整开放读码框(ORF)，起始密码子ATG，终止密码子TAG，在起始密码上游有一个由127个碱基组成的5'非编码区，在终止密码下游有一个由368个碱基组成的3'非编码区，包括1个加poly(A)信号和一个长度为32个腺苷酸的poly(A)尾；该基因推测的氨基酸序列与已克隆的醉酒毒麦、玉米、水稻PLD氨基酸序列的同源性为80％～89％；该基因编码的蛋白是一种相对分子量为92079.2Da、理论等电点为5.24的可溶性蛋白，无跨膜域、无信号肽，主要存在于细胞质中；其二级结构主要以无规卷曲为主；三级结构显示紧靠N端处为C2域，在中间和靠近C端处存在PLD的标志序列即HKD基序；系统进化树显示蒙古冰草PLD与醉酒毒麦的亲缘关系最近，其次是水稻和玉米。本实验克隆了蒙古冰草PLD基因的cDNA全序列并对其进行生物信息学分析，为深入研究该基因的结构、表达和调节机制及其结构和功能的关系奠定了基础，为进一步利用遗传工程提高植物的抗性奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略语表

声明

1引言

1.1蒙古冰草简介

1.1.1蒙古冰草的地理分布

1.1.2蒙古冰草的研究状况

1.2磷脂酶D(PLD)的研究进展

1.2.1磷脂酶D的发现

1.2.2 PLD的结构特点

1.2.3 PLD的亚细胞定位和组织分布

1.2.4 PLD的调控

1.2.5 PLD对环境胁迫和激素的响应

1.3生物信息学在植物抗性基因研究中的应用现状

1.3.1在已知抗性基因研究中的应用

1.3.2在新抗性基因鉴定中的应用

1.4研究的目的及意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.2重要仪器设备

2.3试剂及菌种

2.4引物的设计及合成

2.5蒙古冰草叶片总RNA的提取及检测

2.6 RT-PCR法克隆蒙古冰草PLD基因的中间片断

2.6.1中间片断Ⅰ的克隆

2.6.2中间片断Ⅱ的克隆

2.7 RACE法克隆蒙古冰草PLD基因末端序列

2.7.1 3’RACE法扩增蒙古冰草PLD基因3’末端序列

2.7.2 5’RACE法扩增蒙古冰草PLD基因5’末端序列

2.8生物信息学分析

2.8.1序列同源性分析及多序列比对

2.8.2蛋白质基本性质分析

2.8.3蛋白质结构分析

2.8.4功能位点分析

2.8.5结构功能域的确定

2.8.6系统进化树分析

3结果与分析

3.1总RNA的检测结果

3.2蒙古冰草PLD基因cDNA中间片断的克隆、测序及序列分析结果

3.3蒙古冰草PLP基因RACE产物的克隆、测序及序列分析结果

3.3.1 3’RACE产物的克隆、测序及序列分析结果

3.3.2 5’RACE产物的克隆、测序及序列分析结果

3.4蒙古冰草PLD基因的核苷酸全序列分析

3.5蒙古冰草PLD基因推导的氨基酸序列分析

3.5.1氨基酸序列的同源性及多序列比对分析

3.5.2 PLD基因编码氨基酸序列的性质和结构分析

3.5.3 PLD功能位点分析

3.5.4 PLD结构功能域分析

3.6 PLD系统进化树分析

4讨论

4.1 RACE技术

4.2蒙古冰草PLD的生理生化特性

4.3蒙古冰草PLD的分子生物学特性

5结论

致谢

参考文献

附录

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