小麦WHSP90基因特性分析与W17基因启动子功能鉴定

摘要

植物在逆境条件下能识别各种胁迫信号、激活相应的信号转导途径、诱导植物防卫反应基因转录表达，从而表现出抗逆性。植物HSP90和ERF类转录因子在植物生物和非生物胁迫信号的传递、抗逆相关基因的调控及提高作物的抗逆性起着极其重要的作用。本试验对小麦热激蛋白HSP90基因特性以及ERF类转录因子W17基因启动子的功能进行分析鉴定，为深入了解植物胁迫信号转导、抗逆基因的表达调控和小麦抗逆基因工程研究提供理论基础。主要研究结果如下： 1.WHSP90基因的表达特性分析结果表明：WHSP90基因受高温、干旱、盐、低温、乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）和水杨酸（SA）的诱导，但对各种胁迫响应的时间和强度不同，其中，对ET、高温和干旱响应比较强烈。说明WHSP90可能参与多种信号途径，但在各种胁迫信号途径中发挥不同的作用。 2.WHSP90的亚细胞定位分析显示：构建WHSP90的亚细胞定位重组载体，基因枪法转化洋葱表皮细胞，暗培养24h后共聚焦显微镜下观察，确定WHSP90蛋白的定位。结果表明，WHSP90—GFP融合蛋白激发的荧光在细胞质和细胞核中均有分布，说明WHSP90在细胞质和细胞核里行使功能。 3.WHSP90的原核表达及抗体制备：构建原核表达载体His—WHSP90和GST—WHSP90，进行蛋白诱导：纯化蛋白His—WHSP90，免疫家兔制备多克隆抗体，免疫后兔抗血清效价大于125000，满足后续试验要求的效价值。 4.WHSP90基因转化拟南芥：构建双子叶转基因载体，电击转化法将WHSP90基因转入农杆菌C58C1，真空渗透法转化拟南芥，收集转基因当代植株的种子（T0代），在Kana—MS培养基上筛选，获得转基因拟南芥8株。 5.W17基因启动子功能鉴定：通过Ⅰ—PCR延伸W17基因启动子片段，获得启动子1859 bp。构建W17基因启动子缺失载体，转化小麦成熟胚愈伤组织，并进行化学染色分析。结果显示，经过旱（PEG6000）、脱落酸（ABA）、盐（NaCl）、水杨酸（SA）、赤霉素（GA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、低温和高温胁迫处理的愈伤组织均能够被X—Glus在不同程度上染成蓝色，说明W17基因启动子可能含有受旱、ABA、盐、SA、GA、MeJA、低温、高温胁迫诱导的顺式作用元件，属于逆境胁迫诱导型启动子，且由于胁迫响应元件的数量不同而使GUS基因表达的强弱存在差异。

目录

文摘

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论文说明：缩略语表

声明

1 引言

1.1 HSP90的研究概况

1.1.1 HSP90家族

1.1.2 HSP90的结构特征

1.1.3 HSP90的表达调控机理

1.1.4植物HSP90的生物功能

1.1.5HSP90的研究展望

1.2 ERF转录因子的研究概况

1.2.1 ERF转录因子的主要功能域

1.2.2 ERF转录因子在植物防卫反应中的作用

1.3植物启动子的研究进展

1.3.1植物启动子的结构

1.3.2植物启动子的类型

1.3.3植物启动子的克隆方法

1.3.4 启动子元件生物学分析和预测数据库

1.3.5植物启动子功能的研究方法

1.3.6启动子的研究展望

1.4研究的目的、内容及技术路线

1.4.1 研究的目的意义

1.4.2研究的内容

1.4.3技术路线

2材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2质粒载体及菌种

2.1.3 酶及化学试剂

2.1.4主要溶液成分

2.1.5培养基

2.1.6 PCR引物

2.1.7启动子顺式作用元件在线分析网站

2.2研究方法

2.2.1 WHSP90基因的表达特异性分析

2.2.2 WHSP90的亚细胞定位分析

2.2.3 WHSP90的原核表达及抗体制备

2.2.4 小麦热激蛋白WHSP90基因转化拟南芥

2.2.5 小麦W17基因启动子的克隆及功能的初步分析

3结果与分析

3.1小麦热激蛋白WHSP90基因的表达特异性分析

3.1.1 植物总RNA的提取

3.1.2 WHSP90基因表达特性分析

3.2小麦热激蛋白WHSP90的亚细胞定位分析

3.2.1 16318hGFP-WHSP90融合蛋白表达载体构建

3.2.2 小麦热激蛋白WHSP90的亚细胞定位

3.3 WHSP90的原核表达及抗体制备

3.3.1 WHSP90基因全长的扩增

3.3.2融合表达载体的构建

3.3.3 IPTG不同诱导时间对融合表达的影响

3.3.4 His-WHSP90蛋白的诱导及纯化

3.3.5 WHSP90的多克隆抗体的制备

3.4小麦热激蛋白WHSP90基因的功能鉴定

3.4.1 植物转基因表达载体pBI121-WHSP90的构建

3.4.2 pBI121-WHSP90转化到农杆菌

3.4.3 转基因拟南芥阳性植株筛选

3.5小麦W17基因启动子的克隆及功能的初步分析

3.5.1 I-PCR继续延伸小麦W17基因启动子片段

3.5.2 W17基因启动子序列扩增

3.5.3 W17基因启动子序列分析

3.5.4小麦W17基因启动子的功能鉴定

4讨论

5 结论

致 谢

参考文献

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