固定化胰蛋白酶的微波法高效制备及其性质研究

摘要

固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一种为克服游离酶稳定性能差、成本高、产物纯度低等缺点而应运而生的一种技术，固定化酶已在许多领域显示出重要的应用价值。但是固定化酶的制备过程通常耗时较长，少则几个小时，多则几十个小时。现今，随着科学技术的发展，人们对生活质量的要求越来越高，费时、繁杂的方式和方法不断被淘汰，快速测定技术迅猛发展，人们的生产生活方式越来越快捷。因此探索高效制备固定化酶的方法，以满足生产、应用的需求是必要的。
　　近年来，微波作为一种高效的辅助手段被广泛地应用到科研之中。但目前为止，国内外对微波辅助固定化酶的研究相对较少，且还没有对胰蛋白酶进行微波固定化的研究。因此本课题采用微波固定化的方法来制备固定化胰蛋白酶。
　　本课题研究包括以下四个部分：
　　（1）以ES-105环氧基树脂为固定化胰蛋白酶的载体，在微波辅助的条件下，对胰蛋白酶进行固定化，应用Box-Behnken响应面法设计实验，优化确定了最佳的固定化条件。结果表明，在加酶量为41 mg/g、pH值6.2、微波温度为30℃、微波时间10 min的条件下，制备的固定化胰蛋白酶的活力为322.6 U/g。此酶在25℃~40℃的温度范围内、5~7和9~10的pH值范围内稳定性较好，经过9次使用后还可以保持63.2％的初始酶活力，在4℃环境下贮藏五周后仍能保持初始酶活力的64.6%。
　　（2）以ESR-5伯氨基树脂为固定化载体，在微波辅助的条件下，以戊二醛为交联剂制备固定化胰蛋白酶。应用Box-Behnken响应面法设计实验，优化确定了最佳的固定化条件。结果表明，在加酶量为26 mg/g、戊二醛质量分数为0.53%、pH值为9.1，微波温度为35℃、微波时间为5 min的条件下，制得的固定化胰蛋白酶的活力为390.8 U/g。此酶在25℃~45℃的温度范围内、在8.5~10.0的pH值范围内酶的稳定性较好，经过11次使用后还可以保持86.7%的初始酶活力，在4℃环境下贮藏五周后仍能保持初始酶活力的63.7%。
　　（3）以D151大孔树脂为固定化载体，在微波辅助的条件下，采用吸附-交联法制备固定化胰蛋白酶。采用星点设计-响应面法优化确定了最佳的固定化条件。结果表明，在吸附时间1.5 h、加酶量81 mg/g、戊二醛质量分数1.0%、pH值5.0、微波温度29℃、微波时间3.5 min的条件下，制备的固定化胰蛋白酶的活力为221.5 U/g。此酶在25℃~45℃的温度范围内、在4.0~5.0和9.0~10.0的pH值范围内酶的稳定性较好，经过8次使用后还可以保持73.1%的初始酶活力，在4℃环境下贮藏五周后仍能保持初始酶活力的71.1%。
　　（4）应用各种不同载体制备的固定化酶水解酪蛋白和紫苏饼粕蛋白，以考察各种固定化酶的酶解性能。结果表明，三种不同载体制备的固定化胰蛋白酶水解蛋白后得到的产物有差别，但差别不显著。
　　综上所述，以ESR-5伯氨基树脂为固定化载体制备的固定化胰蛋白酶的酶活力最高，制备过程中酶活力的损失最少；操作稳定性优于其他两种固定化胰蛋白酶，说明通过Schiff反应将树脂和胰蛋白酶交联在一起的化学固定化方式更牢固；其温度稳定性优于ES-105树脂固定化胰蛋白酶；酸碱稳定性和贮藏稳定性与另外两种相差不大；其催化水解蛋白的效果与另外两种固定化胰蛋白酶相差不大，总体而言是三种固定化胰蛋白酶中性能最好的。

目录

声明

第一章 前 言

1.1 固定化酶

1.2 固定化胰蛋白酶

1.3 微波辅助反应

1.4 本课题立题依据及研究内容

第二章 微波辅助环氧基树脂固定化胰蛋白酶

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 实验小结

第三章 微波辅助伯氨基树脂固定化胰蛋白酶

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 实验小结

第四章 微波辅助大孔树脂固定化胰蛋白酶

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 实验小结

第五章 固定化胰蛋白酶的应用

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 实验小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 本论文主要创新点与不足

6.3 展望

参考文献

发表论文、参加科研情况说明

致谢