流式细胞术应用于铜绿假单胞菌体外药敏实验的研究

摘要

目的：传统的抗生素敏感试验包括：稀释法(肉汤稀释法和琼脂稀释法)、纸片扩散法和E．试验，均需要将细菌在药物作用下培养过夜才能观察结果，相当费时费力。目前多采用比浊法目测结果，提供的结果代表细菌生长的均数，对亚菌群的敏感性无法判断。流式细胞仪可同时、快速、多参数地分析单个细胞的生物学特性，已经被应用于生物医学的许多领域。铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosaPA)是医院感染的三大病原茵之一，探索一种快速检测此类细菌及其药物敏感性的方法，对于重症感染性疾病的快速诊断和治疗，预防和治疗医院感染，减少多重耐药菌株的产生与传播，减少患者和医院的负担有重要的经济效益与社会效益。 本试验选择能够通过破损的细胞膜进入细胞并与核酸相结合的荧光染料碘化丙啶(PI)，使其着染于经过抗生素处理后的细菌，用流式细胞仪检测细菌荧光信息的变化，推断细菌对抗生素的敏感性和药物的最低抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)。并与传统的试管稀释法检测结果进行比较，客观判断流式细胞荧光术抗生素敏感试验(Flowcytofluorometricantibioticsusceptibilitytest，FCST)的优缺点，为该方法在临床上的应用积累实验依据。 方法：我们收集了2003-2004年苏州大学附属儿童医院外科及重症监护病房医院感染患儿的临床标本中分离出的铜绿假单胞菌共22株，并购买了质控标准菌株ATCC27853。将细菌转种于血琼脂平板，35℃孵育过夜，次日从平板上挑取1～2个菌落，接种于M-H肉汤培养基中，于35℃恒温水浴箱中培养2小时，用VITEK比浊仪调整菌液浓度至0．5麦氏单位(相当于1．5×10ScFU／m1)。在测定管中加入亚胺培南1．Oral使其终浓度为32．0、16．0、8．O……0．25、O．125ug／ml，然后在测定管中加入细菌悬液1．Oral，调整使其终浓度为7．5×106CFU／ml，37．0~C孵育3小时后加入染料PIlOul(最终浓度为10ug／m)室温避光5分钟后，以流式细胞仪检测104以上个细菌。根据荧光信息的变化判断细菌对药物的敏感性。随着药物浓度的增加，如果碘化丙啶荧光阳性百分率(PI％)或平均荧光强度(MFI)均在狭窄范围内，无明显上升，判断为菌株耐药；若PI％逐渐增至75％或以上，则此时的最低药物浓度为MIC，表示细菌对药物敏感；或MFI突然增加50％或以上，则推断此时的最低药物浓度为MIC，且细菌敏感。 结果：根据NCCLS(NationalcommitteeforclinicalLaboratoryStandard)规定，铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性判断标准为：MIC~<4ug／ml为敏感，MIC≥16ug／ml为耐药。据此，标准菌株ATCC27853与22株临床分离菌株FCST检测结果和试管稀释法检测结果完全一致。 对于编号为19和22的二株铜绿假单胞菌，流式细胞仪检测发现，随着药物浓度的增加PI％虽然有上升，但各个PI％值均在50％以下，同时MFI亦无明显增加，增加幅度不超过40％。我们判断19号和22号菌株对亚胺培南耐药。对于其余20株细菌，随着药物浓度的增加PI％均逐渐增加至75％或以上，或MFI增加幅度超过50％。我们将PI％逐渐增加至75％或以上，或者MFI增幅超过50％或以上的最低药物浓度判定为亚胺培南的MIC，且菌株对药物敏感。 将试管稀释法和FCST检测的MIC相比较，以PI>~75％或以上为判断标准时，22株临床分离菌株中有17株细菌的MIC完全一致(77．3％)，4株细菌MIC相差1个稀释度(18．2％)，l株细菌MIC相差2个稀释度(4．5％)，相差1个稀释度时二者的一致性为95．4％，相差2个稀释度时一致性为100％。以MFI增加50％或以上为判断标准时，有16株检测的结果相同(72．7％)，有5株检测结果相差1个稀释度(22．7％)，有1株检测结果相差2个稀释度(4．6％)。相差1个稀释度时二种方法一致性为95．4％，相差2个稀释度时一致性为100％。证明我们的研究方法是可行的。 结论：1)本研究成功建立了铜绿假单胞菌的流式细胞荧光术药物敏感实验(FCST)的具体操作方法：2)FCST与试管稀释法相比较，药物敏感结果完全一致，FCST方法较传统方法更为简单、快速、准确、客观；3)碘化丙啶荧光阳性百分率(PI％)和平均荧光强度(MFI)均可用来准确推断抗生素的MIC。

目录

文摘

英文文摘

苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明

前 言

材料与方法

实验结果

讨 论

结 论

参考文献

流式细胞术在临床细菌学检测中的应用

研究生期间完成的论文

缩写词表

致 谢