抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建、表达及其生物学活性的初步研究

摘要

本研究在本科室自行研制成功的国内首株激发型抗人CD40单克隆抗体(5C11)的基础上，采用经典的嵌合抗体构建方法，对其进行基因工程改造，并在CHO细胞中实现真核表达，进而对其生物学活性进行初步的研究，以期获得能持续有效分泌特异性的抗人CD40人-鼠嵌合抗体的稳定细胞株，为靶向CD40分子的肿瘤免疫治疗提供必要的物质基础，也期在治疗性单抗的研发领域中取得突破。 第一部分首先采用RT-PCR从特异性分泌抗人CD40单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C11中提取总RNA，常规逆转录，应用简并引物进行PCR扩增，并根据重、轻链基因序列分析结果设计引物，应用SMART-PCR方法扩增含信号肽序列的VH和VL基因，进行测序鉴定。同时采用RT-PCR从人脾脏细胞中抽提总RNA，分别设计特异性引物扩增人IgGlgamma链huFc、huCH1基因和rappa链恒定区基因huCK，再利用TP-PCR方法将huFc和huCHl进行拼接得到人IgGlgamma(CH1-CH3)链恒定区基因，测序鉴定。将含信号肽序列的Vu序列和人的IgG1重链恒定区序列进行拼接获得嵌合重链，将含信号肽序列的VL序列和人的Kappa链恒定区序列进行拼接获得嵌合轻链，拼接产物测序鉴定，构建共表达嵌合重、轻链的重组质粒plRES／hu5C11。plRES／hu5C11重组质粒用脂质体法转染293T细胞，利用CD40-L929和mock-L929细胞株，通过流式细胞术对293T细胞瞬时表达上清中抗人CD40人-鼠嵌合抗体进行鉴定。结果显示，本研究成功构建了含人-鼠嵌合重链和嵌合轻链基因的抗人CD40人-鼠嵌合抗体真核表达载体pIRES／hu5C11。 第二部分选择中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为表达宿主，经试剂盒抽提的plRES／hu5C1l嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞，获得持续稳定分泌表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)的基因转染细胞株(hu5C11-CHO)。RT-PCR鉴定结果表明ch-5C11表达基因成功整合在hu5C11-CHO细胞中；FCM和Westernblot结果表明，一转染plRES／hu5C11质粒的CHO培养上清中含有抗人CD40人-鼠嵌合抗体，其不仅保留了特异识别CD40分子活性，并且含人免疫球蛋白Fc段和K链；利用ProteinG亲和层析纯化细胞培养上清中嵌合抗体，lowy法浓度检测得出抗体产量为0．535mg／L，纯化后的抗体经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯度良好。 第三部分选择高表达人CD40分子的B细胞淋巴瘤细胞株Daudi作为研究对象，对CHO基因工程细胞中表达的ch-5C11的生物学活性进行初步研究。结果表明，ch-5C11能识别Daudi细胞表面CD40分子，光镜下可观察到该嵌合抗体能介导Daudi细胞发生同型聚集，MTT实验还提示该嵌合抗体能抑制Daudi细胞增殖。 综上所述，本实验成功构建了抗人CD40人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)真核表达质粒，并在CHO中实现了稳定表达，表达的嵌合抗体能有效抑制B细胞淋巴瘤细胞株的增殖。

目录

文摘

英文文摘

苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明

研究背景

第一部分抗人CD40人-鼠嵌合抗体表达载体的构建及其鉴定

第二部分抗人CD40人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的稳定表达

第三部分抗人CD40人-鼠嵌合抗体生物学活性的初步研究

小结和展望

本研究所获的基金资助

研究生期间完成的论文

致谢

缩略词表

附录 测序报告

综述 CD40信号和肿瘤免疫