水产品中副溶血弧菌的分离鉴定及部分菌株的耐药性研究

摘要

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,简称V.p),又称嗜盐菌,属于弧菌科,弧菌属。目前在细菌性食物中毒中,由副溶血性弧菌引起的比例比较高,其危害程度也是很大的,仅次于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌,该菌常存在于海水、海产品、海底沉积物、熟肉及盐渍食品中,主要引起人的食物中毒,表现为呕吐、急性腹泻,在东南亚、日本、美国及我国台湾地区比较多见,在我国沿海地区食物中毒中也是最常见的致病菌。随着人们生活水平的提高,全球对水产品安全性更加重视,特别是近几年来,由于海产品在内地城市盛行,内地水产品安全事件也频繁发生,危害程度也日益严重,已经引起人们的高度重视。本研究共收集副溶血性弧菌可疑阳性病料30份,共分离出30株疑似菌株,并对所分离的疑似菌株进行了形态学观察、生化鉴定、血清学分型、耐盐性试验,并对其中5株在分子水平上进行了16SrRNA序列分析,同时对不同血清型的6个本地株进行了耐药性试验。以期为进一步研究副溶血性弧菌感染的临床治疗和公共卫生学意义提供参考依据,同时对现实生产预防和治疗副溶血性弧菌都具有指导意义。
　　 本课题主要研究内容:
　　 (一)收集副溶血性弧菌可疑阳性病料30份:小龙虾样品16份,鱼类样品10份,贝类样品4份(这些样品来自郑州地区不同海产品市场随机取样所得),进行前增凶培养,并用TCBS培养基和科玛嘉弧菌显色培养基进行选择性分离培养,共分离出30株疑似菌株。通过对30株疑似菌株进行形态特征、培养特性等观察及用全自动细菌鉴定分析仪(VITEK-32)进行生化鉴定,初步判定30株疑似菌均为副溶血性弧菌。
　　 (二)检测本地流行株的血清型,不仅对血清流行病学具有一定的意义,而且在对副溶血性弧菌引起的疾病的特异性免疫诊断与防疫方面也具有一定的参考价值。本研究参照GB/T478917—2003技术规程,采用玻片凝集方法,用标准血清对30株分离菌进行了血清学试验。结果表明测试的30株副溶血性弧菌主要分属于01和05两个血清群,分别占60％(18/30)和40％(12/30)。30株试验菌共分6种血清型:01:K3、01:K4、01:K6、01:K7、05:K9、05:K4。
　　 (三)16SrRNA基因序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法。本研究选取5株代表性菌株(小龙虾病料分离出的2株、鱼类病料分离出的2株、贝类病料分离山的1株),通过设计上游引物(5’-GACTCAACACAAGAAGAGATGC-3’),下游引物(5’-ATGCGTGACATCCCAGAAC-3’),用PCR方法分别克隆了其16SrRNA基因序列,根据细菌系统发育学的研究参考相关文献,采用DNA—Star中的MEGAversion软件,依靠Kimura2-PameterDistance分析方法对疑似菌株和己发表菌株进行分析比较,用Neighbor-Joining构建分离菌株的系统发育树,结果表明所测序列与己发表的副溶血性弧菌标准菌株的16SrRNA序列具有高达99％的相似性。对比弧菌属相关菌株的16SrRNA序列和对分离株进行系统发育树分析,确定该5株菌都为副溶血性弧菌。
　　 (四)参照血清学试验结果,选取6株不同血清型的副溶血性弧菌进行约敏试验,采用药敏纸片法进行了头孢他啶、氨苄西林、庆大霉素、多粘菌素、左氧氟沙犀、头孢唑啉、头孢呋辛钠、链霉素等的药敏试验。从结果可以看出6株副溶血性弧菌的耐药性基本一致,绝大多数对氨苄西林、庆大霉素、头孢他啶、链霉素敏感；对多粘菌素、左氧氟沙星、头孢唑啉、头孢呋辛钠具有耐药性,尤其是对多粘菌素耐药性最高,耐药率为83.3％。