口腔鳞癌细胞裂解物致敏的树突状细胞免疫活性及其体外抗肿瘤作用的研究

摘要

目的：树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presentation cell，APC)，其抗原提呈能力是其它抗原提呈细胞(M<,ψ>,B细胞等)的 10-100倍。它是体内唯一能激活静息型 T 细胞，激发初始免疫应答和记忆免疫应答的免疫细胞，在体内发挥强大的免疫监视功能。但在肿瘤患者体内，由于肿瘤微环境的影响，使DC功能缺陷，从而不能有效递呈肿瘤抗原，导致免疫无能或免疫耐受，造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，使肿瘤得以发生发展。随着DC体外扩增诱导技术和分子生物技术等的发展，以DC为中心的免疫治疗越来越受到人们的关注，DC瘤苗有望成为肿瘤免疫治疗的一种有效方式。以DC为中心的抗肿瘤免疫治疗研究已在国内外广泛开展，已有DC疫苗应用于黑色素瘤，前列腺癌，B细胞淋巴瘤，多发性骨髓瘤，纤维肉瘤，肾癌等的治疗并取得了一定的临床效果，但在口腔癌的治疗中，DC的疫苗研究尚处于起步阶段。以DC肿瘤疫苗为基础的主动免疫治疗可以克服手术等常规疗法的种种不足且具有高效安全的特点。这种疗法己成为国内外肿瘤免疫治疗的新方向和新热点。DC疗法的关键是体外肿瘤抗原负载DC的获得，并能有效激发T细胞活化和增殖，从而能介导机体的抗肿瘤效应，其中以癌细胞裂解物负载DC的方法相对其他抗原致敏方法更加简单有效。 本研究的目的在于通过比较口腔癌患者的DC在抗原负载前后表面分子的差异，分泌IL-12p70的能力，以及刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力和杀伤实验等，以观察口腔癌患者冻融抗原致敏后的DC在体外的免疫活性和对口腔癌细胞的特异性杀伤效应，为口腔癌的生物治疗提供理论依据。 方法：研究对象为20例经术后病理证实的口腔鳞癌患者(河北医科大学第四医院口腔科2005年3月至2006年10月住院)，均未行过任何抗肿瘤治疗，无系统性疾病，不处于急慢性炎症期的口腔癌初诊患者，发病部位包括舌、颊、牙龈、口底等处，临床分期为Ⅲ期和Ⅳ期，年龄在20～60岁范围内，性别比为1：1。 1. 外周血树突状细胞的分离培养无菌采集每人外周血(20ml)，经密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)为前体细胞。用含 10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养，在 37℃，5％CO<,2>条件下孵育两小时(每孔终体积达3ml的6孔培养板中)，两小时后，轻轻洗去非贴壁细胞，获得黏附细胞。黏附细胞经含1000U/mlrhGM-CSF和 500U/ml rhIL-4的RPMI1640完全培养液诱导培养，37℃，5％CO<,2> 孵育，隔天半量换液，于第5天加入 TNF-α200U/ml以促进其成熟。 2.肿瘤细胞裂解物的制备及DC的致敏于37℃，5％CO<,2>条件下以完全培基培养Tca83细胞，每2-3天换液一次，收集对数生长期的细胞并确定细胞活力在95％以上，调细胞浓度为1×10<'7>/ml，并用反复冻融法制备肿瘤裂解物，收集备用。于细胞培养的第6天于一组 DC(细胞浓度 1×10<'6>/ml)中加入制备好的肿瘤裂解物(以抗原与DC比为 10：1加入癌细胞冻融抗原，抗原量以冻融前肿瘤细胞量计算)与其共培养，并于第10天收集各组悬浮和轻度贴壁的细胞即为树突状细胞。 3．各组DC的鉴定培养过程中，每天在倒置显微镜下观察各组DC的生长情况，并于第10天以流式细胞法(FCM)检测DC细胞表面分子CDla、CD83、HL-A-DR、CD86、CD80的表达，以鉴定各组DC的成熟程度。以酶联免疫吸附法(ELISA)检测DC被致敏前后培养上清液中IL-12p70的分泌水平。 4．T细胞的分离和培养实验初始时，将PBMC用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基，37℃，5％CO<,2>条件下孵育两小时后，将培养上清及清洗出的非贴壁细胞收集，调细胞浓度为 2×10<'6>/ml，加冻存液至冻存管后，梯度冻存备用。使用时将其复苏后用含10％胎牛血清，200U/ml的rhIL-12、2mmol/l谷氨酰胺的RPMI1640培养液培养7天。 5．同种混合淋巴细胞反应(MLR)将复苏并培养后的T细胞作为反应细胞，肿瘤裂解物致敏前后的DC作为刺激细胞，各组DC与T细胞分别以1：5、1：10、1：20的比例进行混合共育，诱导其增殖分化，以四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定致敏前后的DC对T细胞的增殖活性。 6．DC诱导肿瘤抗原特异性CTL的杀伤效应培养Tca83及3AO癌细胞作为靶细胞，致敏前后DC激活的CTL作为效应细胞，效靶比分别为 5：1、10：1、20：1。以乳酸脱氢酶释放法(LDH)，进行CTL的体外细胞毒试验以检测口腔癌Tca83细胞裂解物致敏DC后诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对口腔癌细胞Tca83及卵巢癌3AO细胞的杀伤活性。 结果：经口腔鳞癌患者(OSCC)外周血 PBMC 分离培养的树突状细胞具有典型的形态及表面分子 CDla(83.3±6.8)％、CD83(80.6+7.1)％、HLA-DR(88.17±10.79)％、CD86989.2±10.2、)％、CD80(81.2±6.3)％高表达；树突状细胞分泌IL-12p70的量随培养天数的增加而提高，且肿瘤裂解物负载后的DC组分泌量高于未负载组(P<0.001)，肿瘤裂解物负载后的DC组刺激T细胞增殖的能力(P<0.001)和对肿瘤细胞的杀伤活性也均比未负载组显著提高(P<0.001)，Tca83抗原负载后的DC组对Tca83的细胞毒作用明显高于其对3AO癌细胞的细胞毒作用(P<0.001)。 结论：联合应用细胞因子 rhIL-4、rhGM-CSF和 TNF-a，可以从口腔癌患者的PBMC诱导出大量成熟DC，且加入口腔癌裂解物抗原负载后并不影响 DC 的正常分化成熟；经口腔癌裂解物负载后的DC，可分泌更多的IL-12p70，在DC刺激CTL过程中发挥重要作用；经口腔癌裂解物负载后的DC，仍可诱导自体混合淋巴细胞强烈的增殖反应，高效活化CTL，对口腔癌细胞Tca83具有强大的特异性杀伤作用，这就为口腔癌的DC临床治疗提供了一定的实验依据。

目录

摘要

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 DC疫苗的制备及其在肿瘤免疫中的研究进展

致谢

个人简历