NGB基因转染对庆大霉素致豚鼠耳聋保护作用的实验研究

摘要

目的：脑红蛋白(neuroglobin，NGB)是存在于人和小鼠脑内的一种携氧球蛋白，研究证明[1]其具有高的氧亲和力且能与氧可逆性结合的能力。本研究将前期实验构建成功[2]的携带绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的重组质粒pEGFP-NGB与阳离子脂质体复合物经圆窗注入豚鼠耳蜗，术后庆大霉素肌注给药。采用听性脑干反应(ABR)检测实验豚鼠的听阈，通过耳蜗基底膜铺片、扫描电镜以及免疫组织化学染色观察毛细胞和螺旋神经节细胞形态改变以及NGB蛋白表达情况，以此来验证阳离子脂质体介导NGB基因转染对庆大霉素致豚鼠耳聋的保护作用。 方法：将经ABR检测听阈均不超过40dBSPL的120只健康花色豚鼠随机分为五组，每组24只(实验过程中部分动物死亡，实际实验数据按照每组21只统计)：I组：空白对照组(不给药)；II组：人工外淋巴液对照组(经左耳注入人工外淋巴液后不给庆大霉素)；III组：人工外淋巴液实验组(经左耳注入人工外淋巴液后庆大霉素给药)；IV组：空质粒转染组(经左耳注入空质粒pEGFP-C1后庆大霉素给药)：V组：NGB基因转染组(经左耳注入pEGFP-NGB后庆大霉素给药)，其中庆大霉素均经后腿肌注120mg/kg/d，给药14天后，停止给药喂养14天进行检测。所有豚鼠经ABR再次检测后，各组取6只行耳蜗标本硝酸银染色后基底膜铺片观察毛细胞形态；取6只行扫描电镜观察基底膜毛细胞表面结构；取9只行耳蜗免疫组织化学染色检测基底膜毛细胞和螺旋神经节细胞中NGB蛋白的表达情况。 结果：ABR检测结果示空白对照组和人工外淋巴液对照组阈值均小于40dBSPL，人工外淋巴液实验组和空质粒转染组阈值均大于110dBSPL，NGB基因转染组阈值范围为70-110dBSPL；耳蜗基底膜铺片和扫描电镜示空白对照组和人工外淋巴液对照组内外毛细胞排列整齐，无缺失，人工外淋巴液实验组和空质粒转染组内外毛细胞极少量残存，其中ABR阈值大于135dBSPL者毛细胞几乎消失殆尽，NGB基因转染组毛细胞部分缺失，且主要是外毛细胞；免疫组织化学染色示耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞处NGB蛋白表达量以NGB基因转染组较其余各组均显著增高，其余各组几乎均未见明显阳性表达。 结论：ABR示NGB基因转染后阈值增幅减小，听功能受损有一定程度减轻；耳蜗基底膜铺片和扫描电镜示NGB基因转染后毛细胞的病理改变有一定程度减轻；免疫组织化学染色示NGB基因转染后在耳蜗基底膜毛细胞及螺旋神经节细胞等处NGB蛋白表达量明显增高。本研究成功验证了阳离子脂质体介导NGB基因转染对庆大霉素致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

材料和方法

一实验材料

二实验方法

结果

一质粒电泳图

二各组动物给药前、给药后ABR阈值测试结果比较

三各组动物耳蜗基底膜铺片和扫描电镜结果比较

四各组动物耳蜗标本免疫组织化学染色检测基底膜毛细胞和螺旋神经节细胞的NGB蛋白表达量

讨论

结论

参考文献

综述 内耳毛细胞再生的基因调控与基因治疗研究进展

致谢

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