环磷酰胺对大鼠卵巢功能损害的实验研究

摘要

医源性卵巢功能损害已经成为目前临床上一个亟需解决的难题。近二十几年来，由于新的化疗药物应用和采用新的更合理、有效的化疗方案，肿瘤患者生存率明显提高，尤其对于某些肿瘤如恶性淋巴瘤、乳腺癌等患者，可明显延长生存期，甚至可达到治愈。据统计在2000年，每1000个成人中就有1人曾在青少年时期进行过抗癌治疗。据报道，64％的成年女性病人经历肿瘤治疗后伴随有一项或多项卵巢功能衰竭的症状，其中化疗所致的卵巢功能损害虽不影响原发病的无病生存期，但可严重影响患者的生活质量，而且直接促进某些严重疾病的发生，如卵巢早衰导致年轻妇女不育、提前闭经引起的一系列内分泌变化等，可增加心血管疾病的发生率，也可导致骨质疏松。因此，研究和防治化疗相关性卵巢功能损伤具有重要意义。 据国内外报道，环磷酰胺(CTX)是影响卵巢功能最大的化疗药物之一。化疗引起的卵巢早衰与病人年龄和化疗药物的种类、累积剂量、药物浓度及用药持续时间密切相关。临床上无法以获取人类卵巢组织的方式进行卵巢储备功能的相关研究，此外，化疗时多为联合用药，因而较难评估单个化疗药物对卵巢功能的影响。本研究拟用CTX单一药物作用于大鼠，通过观察比较用药前后大鼠卵巢的各级卵泡数目、血促卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E<,2>)、卵巢重量、大鼠阴道涂片了解动情周期变化这几个指标来评价卵巢储备功能，同时观察用药后不同时限的大鼠卵巢储备功能改变情况，比较不同月龄组的大鼠用药后卵巢功能的改变，从而为指导临床选择实施卵巢功能保护的对象提供重要信息。 研究目的 1．建立CTX对卵巢功能损害的大鼠模型。 2．观察检测CTX作用下卵巢功能变化的相关指标。 3．观察CTX用药后大鼠卵巢储备功能变化的相关因素。 4．观察CTX对不同月龄大鼠卵巢功能的影响。 研究内容与方法 1．研究对象： 60只清洁级成年Spragne-Dawley(SD)雌性大鼠，鼠龄60～70天，体重230±10g；36只清洁级未成年(SD)雌性大鼠，鼠龄3周，体重50±5g，均购自中山大学动物实验中心，合格证号：SCXK(粤)2004-0011。给予标准光照(14小时光照、10小时黑夜)，全价颗粒饲料喂养，自由摄食，室温20-25℃，相对湿度45～55％。 2．研究方法： 2．1 大鼠卵巢功能损害模型的建立 60只60～70天的清洁级成年雌性SD大鼠分为空白对照组(生理盐水组)和环磷酰胺(CTX组)分别于用药后3天、1周、2周、4周、8周观察动情周期、称取卵巢重量、进行卵巢组织形态学观察及卵泡计数、测定血清E<,2>、FSH，评估卵巢储备功能，从而建立大鼠卵巢功能损害模型。 2．2 分组与用药 2．2．1 将进入实验的60只60～70天的清洁级成年雌性SD大鼠随机分成2组：空白对照组和CTX组，即Ⅰ组和Ⅱ组。每组30只。 Ⅰ组(空白对照组)：用0.9％生理盐水腹腔注射1ml一次，以上动物均在用药后每日定时取阴道分泌物涂片观察动情周期，分别于用药后3天、1周、2周、4周、8周于动情期处死动物，分为Ⅰ A组、Ⅰ B组、Ⅰ C组、Ⅰ D组、Ⅰ E组，每组均为6只。取血清置入-80℃冰箱待测。取左侧卵巢称取湿重后，左侧卵巢送病理检查。Ⅱ组(CTX组)：CTX 75mg/kg腹腔注射一次。处理同上，分为ⅡA组、ⅡB组、Ⅱ C组、Ⅱ D组、Ⅱ E组，每组均为6只。 2．2．2 将进入实验的36只3周龄清洁级未成年雌性SD大鼠随机分成2组：空白对照组(生理盐水组)和环磷酰胺(CTX)组，即Ⅲ组和Ⅳ组，每组18只。 Ⅲ组(空白对照组)：用0.9％生理盐水腹腔注射0.6ml一次，分别于用药后3天、1周、2周处死动物，分为ⅢA组、ⅢB组、ⅢC组，每组为6只。取血清置入-80℃冰箱待测。取左侧卵巢称取湿重后，左侧卵巢送病理检查。 Ⅳ组(CTX组)：CTX 100mg/kg腹腔注射一次。处理同上，分为ⅣA组、ⅣB组、ⅣC组，每组均为6只。 2．3 实验检测指标 2．3．1 大鼠动情周期的观察：取阴道分泌物涂片苏木素伊红染色后镜检。 2．3．2 卵巢重量的影响：取左侧卵巢，以电子称称重。 2．3．3 卵巢组织形态学观察及卵泡计数：病理切片为连续5μm切片，每间隔9张取一张切片(即第10张)，计算卵泡数，累积计数每个卵巢原始卵泡、初级卵泡、生长卵泡和成熟卵泡数目。 2．3．4 大鼠血清E<,2>、FSH的测定：采用双抗体夹心ELISA法。 结果 1．本研究成年ⅡA组、ⅡB组、ⅡC组、ⅡD组、ⅡE卵巢原始卵泡数分别与对照组比较，原始卵泡数均减少，差异有显著性(p<0.05)。成年ⅡA组、ⅡB组、Ⅱ C组初级卵泡数、生长卵泡数、成熟卵泡数分别与对照组比较，初级卵泡、生长卵泡、成熟卵泡数增多，有统计学差异(p<0.05)。成年ⅡA组、Ⅱ B组、ⅡC组、ⅡD组血清E<,2>分别与对照组比较，血清E<,2>降低，有统计学差异(p<0.05)。成年ⅡA组、ⅡB组血清FSH分别与对照组比较，血清FSH升高，有统计学差异(p<0.05)。成年CTX组大鼠第1、2周阴道涂片显示动情周期发生改变，规则的动情周期变化消失，周期延长为8～17天，绝大多数停止于动情间期。成年ⅡB组、ⅡC组、ⅡD组、ⅡE组卵巢重量分别与对照组比较，卵巢重量减轻，有统计学差异(p<0.05)。显示，CTX 75mg/kg腹腔注射一次，用药后3天、1周、2周卵巢功能均受到损害，CTX对大鼠卵巢功能损害的模型建模成功。 2．CTX对未成年大鼠卵巢功能的影响：未成年ⅣC组大鼠卵巢初级卵泡数减少，ⅣB组生长卵泡数增加，与对照组比较有统计学差异(p<0.05)。ⅣA组、ⅣB组、ⅣC组原始卵泡数、成熟卵泡数与对照组比较，两者差异无显著性意义(p>0.05)，ⅣB组血清E<,2>、FSH 与对照组比较，血清E<,2>降低，FSH升高，有统计学差异(p<0.05)，而未成年ⅣA组、ⅣC组血清E<,2>、FSH与对照组比较，两者差异无显著性意义(p>0.05)。ⅣC组大鼠卵巢重量减轻，与对照组比较，两者差异有显著性意义(p<0.05)，ⅣA组、ⅣB组大鼠卵巢重量分别与对照组比较，两者差异无显著性意义(p>0.05)。 结论 1．本研究采用CTX 75mg/kg单次腹腔注射用药建立CTX对卵巢功能损害的大鼠模型，成本低，手术操作简便，建模成功率高，对于研究化疗引起卵巢功能损害的机理、卵巢功能保护等是良好的动物实验模型。 2．本研究结果显示CTX作用下卵巢形态学改变最显著的是原始卵泡数目减少，提示这可能是其减少卵巢储备量，致卵巢功能受损的主要机制之一。 3．本研究结果提示卵巢功能损害与大鼠月龄关系密切。CTX明显减少成年大鼠卵巢的原始卵泡数且不可逆，而对未成年大鼠卵巢储备功能也有轻微损害作用。随着月龄的增长，CTX对卵巢的这种作用也越明显。

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结论

本研究的局限性和进一步的研究设想

参考文献

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