野生型MxA蛋白及其突变体抑制HBV复制活性研究

摘要

研究背景： MxA蛋白由662个氨基酸残基组成，是大GTP酶蛋白超家族成员和动力素超家族成员，分子量为76KD。MxA蛋白有GTP酶活性，即该蛋白有结合GTP的活性和水解GTP能力。MxA蛋白通过N端氨基酸GTP结合元件结合外源性GTP；C端氨基酸含有GTP酶水解效应区，能够将内源或外源GTP降解为GDP。 研究目的： 1、研究MxA蛋白在HepG2细胞中抑制HBV复制活性。 2、E645R变异是否影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。 3、GTP酶活性是否是影响MxA蛋白抑制HBV复制的关键因素。 4、MxA蛋白是否主要抑制HBV的核内复制阶段。 研究方法： 1、野生型和GTPase缺陷型MxA蛋白表达载体的鉴定：pcDNA3.1-Flag-MxA(wild-type)，pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A，pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612K重组载体转化DH5a，挑选阳性克隆，经过PCR鉴定和双酶切鉴定后进一步测序鉴定；测序结果与pubmed公布序列通过DNAsis软件比对。用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)中量抽提以上各质粒和空质粒pcDNA3.1(+)。 2、野生型MxA蛋白抑制HBV复制活性研究：用HiSpeedPlasmidMidiKit(Qiagen)大量抽提重组质粒pU19-1.24HBV。常规方法培养HepG2细胞。按5×106细胞/皿将细胞接种到直径10cm细胞培养皿中培养24小时细胞贴壁后待转染。 3、检测Flag-MxA蛋白抑制HBV过程中是否发生降解：实验组取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重组质粒分别为10μg和5μg共转染；对照组取pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒10μg，pU19质粒和SalmonDNA共5μg共转染HepG2细胞，两组pSeap质粒均取0.3μg，转染3天后，收集细胞裂解，蛋白定量后westernblot检测细胞内Flag-MxA蛋白表达水平。 4、检测Flag-MxA蛋白抑制HBV过程中是否发生重新分布：实验组取pcDNA3.1-Flag-MxA和pU19-1.24HBV重组质粒分别为10μg和5μg共转染HepG2细胞；对照组取pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒10μg，pU19质粒和SalmonDNA共5μg共转染HepG2细胞，3天后取出载玻片，常规方法使用anti-Flag单克隆抗体染Flag-MxA蛋白，HO33342染细胞核，激光共聚焦观察Flag-MxA蛋白在细胞核内外分布。 5、E645R变异MxA重组载体(pcDNA3.1-Flag-MxAE645R)构建：我们在pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒基础上采用定点突变获得pcDNA3.1-Flag-MxAE645R重组质粒。 6、E645R变异MxA蛋白抑制HBV复制活性研究：常规方法培养HepG2细胞接种到直径10cm细胞培养皿中，培养24小时细胞贴壁后待转染。 7、GTP酶缺陷型MxA变异体对HBV复制的影响：常规方法培养HepG2细胞接种到直径10cm细胞培养皿中，培养24小时细胞贴壁后待转染。 8、野生型MxA蛋白和T103A变异蛋白的核内表达型重组载体(pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103)的构建：pcDNA3.1-HA-MxA(wild-type)和pcDNA3.1-HA-MxA(T103A)两种载体转化DH5α，挑选阳性克隆，经过PCR和双酶切鉴定后进一步测序鉴定。测序结果与pubmed公布序列通过DNAsis软件比对。 9、MxA蛋白核内表达型抑制HBV复制研究：pcDNA3.1-HA-MxA(wild-type)和pcDNA3.1-HA-MxA(T103A)与各自核内表达型载体(pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103)使用HiSpeedPlasmidMidiKit提取质粒。 结果： 1、MxA表达载体鉴定：pcDNA3.1-Flag-MxA(wild-type)，pcDNA3.1-Flag-MxA-K83A，pcDNA3.1-Flag-MxA-T103A和pcDNA3.1-Flag-MxA-L612K重组载体经酶切和测序鉴定并与PUBMED公布的人MxA序列比对表明各载体序列正确。定点突变获得的pcDNA3.1-Flag-MxAE645R载体经测序序列正确。pcDNA3.1-HA-MxAandpcDNA3.1-HA-T103A经酶切和测序表明序列正确；核内表达型载体pcDNA3.1-HA-TMxA和pcDNA3.1-HA-T103测序结果也表明正确插入了SV40大T抗原核内转移信号肽。 2、野生型MxA蛋白抑制HBV复制结果：Westernblot检测pcDNA3.1-Flag-MxA重组质粒和pU19-1.24HBV重组质粒按1:1、2:1共转染HepG2细胞时，按2:1比例共转染时MxA蛋白表达较1:1时强。与对照组相比，按1:1比例转染时MxA组HBeAg下降27％，HBsAg与对照组差别没有显著性意义(P>0.05)。转染比例按2:1比例转染时MxA组的HBeAg较对照组下降65％，差别有显著性意义(P<0.01)；HBsAg与对照组下降21％(P<0.05)。各组上清进行real-timePCR检测显示1:1转染时MxA组较对照组上清HBVDNA水平分别下降1.05个log10值，细胞内HBVDNA下降0.68个log10值。2:1转染时MxA组较对照组上清HBVDNA水平下降1.91个log10值，细胞内HBVDNA下降1.69个log10值。 3、抑制HBV复制时MxA蛋白的表达和分布：Westernblot检测结果显示MxA蛋白抑制HBV组与对照组MxA蛋白表达没有明显差别；激光共聚焦显微镜显示在没有HBV复制的HepG2细胞中Flag-MxA蛋白主要分布于细胞浆，而在HBV复制的HepG2细胞中Flag-MxA蛋白部分发生了核内移。 4、MxA蛋白E645R变异载体抑制HBV复制：Westernblot检测结果表明MxA组和E645R组有较好的Flag-MxA蛋白表达；MxA组和E645R组上清进行abbott检测显示MxA组和E645R组HBsAg较对照组分别下降21％和24％；HBeAg分别下降65％和59％，差异具有显著意义(P<0.01)。MxA组和E645R组间HBsAg和HBeAg表达水平差异没有显著性意义(P>0.05)。各组进行realtimePCR检测显示MxA组和E645R组较对照组上清HBVDNA水平分别下降1.91个和2.22个log10值，细胞内HBVDNA分别下降下降1.69和1.70个log10值。 5、GTPase活性缺陷型载体对HBV复制的抑制：Westernblot结果显示各组MxA蛋白均有较好的表达，对照无表达。与对照组相比，上清中的HBeAg在野生型组、K83A、T103A和L612K变异组的表达分别下降73％，71％，73％和70％(P<0.01)；上清的HBsAg水平在野生型组、K83A、T103A和L612K变异组的表达分别下降41％，41％，44％和41％(P<0.01)；上清HBVDNA水平分别下降2.22，2.11，2.23和2.18log10(P<0.01)，细胞内HBVDNA水平下降1.89，1.78，1.72和1.93log10(P<0.01)。在K83A、T103A和L612K变异组上清HBVDNA水平、HBsAg和HBeAg水平和细胞内的HBVDNA水平与野生型组比较差异没有显著性意义(P>0.05)。 6、TMXA和T103抑制HBV复制的结果：Westernblot结果显示各组均有较好的HA-MxA蛋白表达。激光共聚焦结果显示在转染TMxA和T103载体的HepG2细胞中，MxA蛋白主要以细胞核内表达为主；而胞浆型MxA载体和T103A载体在抑制HBV过程中仅部分核内移，说明我们的核内表达型载体提高TMxA的核内表达浓度。与对照组相比，在MxA，TMxA,103和T103组，细胞外HBeAg水平下降28％，9％，28％和10％；细胞外HBVDNA水平分别下降88％，44％，88％和39％；细胞内HBVDNA分别下降81％，350/o，76％和42％。TMxA和T103组细胞外HBeAg水平和胞内胞外HBVDNA水平均显著低于对照组(P<0.01)，但分别显著高于MxA和103组的水平(P<0.01)。 结论： 1、MxA蛋白在HepG2细胞中抑制HBV复制；E645R变异不影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。 2、MxA在抑制HBV过程中可能不发生降解但发生核内移，MxA蛋白核内移的机理仍在进一步研究中。 3、GTP酶缺陷型MxA载体(K83A,T103A,L612K)抑制HBV复制的活性与野生型MxA蛋白抑制活性基本相当，推测GTP酶活性对MxA抑制HBV复制活性没有关键性的作用。 4、提高核内表达的MxA蛋白不能提高其抑制HBV的复制活性，提示MxA蛋白可能只轻微作用于HBV核内的复制过程；MxA蛋白可能作用于HBV复制的多个阶段。

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文摘

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论文说明:中英文缩略语

声明

研究背景

第一章MxA蛋白抑制HBV复制活性研究

1.1导言

1.2主要材料和方法

1.3结果

第二章E645R变异MxA蛋白抑制HBV复制的体外研究

2.1前言

2.2.材料和方法

2.3结果

第三章GTPase活性缺陷型MxA蛋白抑制HBV复制的体外研究及意义

3.1前言

3.2材料和方法

3.3结果

第四章核内表达型MxA蛋白抑制HBV复制的体外研究及意义

4.1引言

4.2主要的材料和方法

4.3结果

全文讨论

全文总结

参考文献

攻读学位期间主要成果

致谢