人CYP2C19.1野生型和CYP2C19.2突变体蛋白体外表达模型的构建、活性表征及抑制剂研究

摘要

本课题考察了慢病毒介导、pcDNA3.1(+)介导及杆状病毒表达系统等几个体外表达系统,成功通过Bac-to-BacTM系统异源表达了人CYP2C19.1野生型和CYP2C19.2突变体蛋白;并利用经典底物和抑制剂验证异源蛋白的活性;同时筛选了70个中药单体,首次发现多个对CYP2C19具有抑制作用的单体。
　　 目的体外异源表达人CYP2C19.1野生型和CYP2C19.2突变体蛋白,考察其代谢动力学参数,为药物Ⅰ相代谢的研究提供单一性的酶源;同时进行抑制剂的体外筛选研究。
　　 方法分别使用慢病毒介导的稳定表达系统、pcDNA3.1(+)介导的稳定表达系统及杆状病毒表达系统在体外表达人CYP2C19.1野生型及CYP2C19.2突变体蛋白。以人肝组织RNA为模板进行RT-PCR扩增反应,获得CYP2C19基因的cDNA序列,然后通过定点突变获得突变体的cDNA序列。将这些基因分别连接至各自载体质粒上进行后续的质粒构建、转染及蛋白表达过程。其中在杆状病毒表达系统中,用构建好的重组CYP2C19s杆状病毒,与本实验室已构建好的重组CYPOR、CYPb5杆状病毒一起感染Sf9细胞,在优化后的最佳共表达条件下获得相应重组酶。以奥美拉唑为底物分别检测重组酶的活性,并比较CYP2C19野生型与突变体蛋白之间的代谢动力学参数差异。测定经典底物噻氯吡啶和氟伏沙明作用于CYP2C19的IC50值和Ki值,验证重组酶用于抑制剂筛选的可行性;将此重组酶用于实验室已有的70种中药单体的抑制剂筛选,并详细测定了其中三种单体异土木香内酯、莪术醇及五味子甲素作用于CYP2C19的IC50值和Ki值。
　　 结果对三种表达系统的考察结果表明,慢病毒介导的稳定表达系统、pcDNA3.1(+)介导的稳定表达系统均未能成功表达相应蛋白,杆状病毒表达系统仍是目前实验室用于异源表达P450酶的最有效的系统.Westernblot实验结果显示CYP2C19蛋白获得了有效的表达.以奥美拉唑为代谢底物测得,CYP2C19.1的酶动力学参数如下:Km为(4.99±0.22)μmol·L-1,Vmax为(0.2539±0.0024)μmol·min-1·mg-1protein,Clint为0.0509L·min-1·mg-1protein;CYP2C19.2的酶动力学参数如下:Km为(5.822±0.27)μmol·L-1,Vmax为(0.5481±0.0058)μmol·min-1·mg-1protein,Clint为0.0941L·min-1·mg-1protein。噻氯吡啶抑制CYP2C19.1和CYP2C19.2蛋白代谢奥美拉唑的IC50值分别为2.28μmol·L-1和2.47μmol·L-1,Ki值分别为(0.64±0.025)μmol·L-1和2.038μmol·L-1;氟伏沙明对CYP2C19.1和CYP2C19.2蛋白代谢奥美拉唑的IC50值均为0.19μmol·L-1,Ki值分别为(0.29±0.090)μmol·L-1和0.041μmol·L-1。同时发现白藜芦醇、大黄素、异土木香内酯、莪术醇、薄荷脑、鬼臼毒素、补骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、新狼毒素B等对人CYP2C19具有较强的抑制能力。
　　 结论实验成功建立CYP2C19.1野生型和CYP2C19.2突变体蛋白的体外表达模型并获得了具有良好活性的重组酶,该重组酶适用于CYP2C19的体外底物及抑制剂筛选,并为药物经过CYP2C19代谢和基因组学的体外研究提供了重组蛋白模型.