一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法

摘要

本发明提供了一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法。本发明改造的mpNTKV‑LoxP载体更适合于构建基因打靶载体特别是基因替代目的，新加入的Pac I和Swa I都是识别八个碱基的限制性内切酶，有利于较大DNA片段的插入。构建的MYH9基因替代(即内源MYH9基因被外源编码非肌性肌球蛋白重链II基因所替代)打靶载体通过电转导入小鼠ES细胞中，经过药物筛选，ES细胞单克隆挑选，Southern Blot或PCR鉴定，发生同源重组的阳性单克隆细胞率高达90％以上，易于获得所需细胞系。使用阳性ES细胞显微注射至小鼠囊胚获得MYH9基因替代嵌合体小鼠，并且该嵌合体小鼠可以交配传代，从而获得MYH9基因替代杂合子及纯合子后代。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法及其应用示范

背景技术

基因敲除是80年代末应用DNA同源重组原理发展起来的一种新型分子生物学技术，即通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。该技术发展经历了三个主要过程：即80年代初ES细胞分离和体外培养为基因敲除奠定了技术基础；1985年首次证实哺乳动物细胞中同源重组现象的存在为基因敲除奠定了理论基础；1987年完整的基于ES细胞的基因敲除小鼠模型的建立标志着该技术的成熟。在此基础上发展起来的条件性或诱导性基因敲除体系使得对基因在时间和空间上的修饰更加明确、效果更加完美，从而在研究可能导致胚胎致死的一些重要基因，以及确切了解某个基因在特定发育阶段或特定组织的功能中发挥了重要作用。近年来出现的依赖锌指核酸酶(ZFN)、转录因子样效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复及其关联蛋白系统(CRISPR/Cas9)的基因组编辑技术进一步推动基因敲除的发展与应用。需要指出的是，这些新技术仍存在或是构建复杂、或是灵活性差、或是脱靶效应等问题，还处在不完全成熟阶段。因此，时至今日基于ES细胞和利用DNA同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最可靠和最普遍的使用方法。

生物体内存在众多的基因或蛋白家族，它们结构和功能相似。II型非肌性肌球蛋白(Nonmuscle Myosin II,NM II)是肌球蛋白超家族的一员，与actin结合构成细胞中的分子马达。所有的myosinⅡ具有相似的结构，即由两条重链(171-244kDa)、两条调节轻链和两条必需轻链(16-23kDa)组成的六聚体。两对轻链结合于一对重链的氨基末端形成球形头部，具有ATP酶活性以及actin结合位点；重链的羧基末端通过卷曲式螺旋形成杆状尾部。哺乳动物中NM II分为三种亚型，这是由重链的不同而决定的。三个基因(MYH9,MYH10,MYH14)分别编码NM重链II(Nonmuscle myosin heavy chain II，NMHC II)NMHCIIA，NMHCIIB和NMHCIIC。一对相同的重链与两对轻链结合形成的六聚体复合物分别为NM IIA，NM IIB,NMIIC。NM II除了为细胞运动提供动力外，还参与细胞各种生理活动，如细胞的迁移与黏附、胞质分裂等。应用基因敲除技术在小鼠中分别将MYH9和MYH10基因失活，揭示这些NM II蛋白为小鼠早期发育所必需。同时，由于MYH9和MYH10基因敲除小鼠的胚胎致死性，限制了进一步了解这些蛋白在生物体内的功能；大多数细胞中表达不止一种NM II亚型，这些不同亚型NM II在体内特定功能仍不清楚；不同亚型NM II在细胞和组织中的表达存在一定的特异性，这是否造成它们功能的差异呢？此外，MYH9基因的单个点突变引起一类统称为MYH9相关疾病，目前已知造成这类疾病的MYH9基因点突变就高达40多个，遍布在NMHC IIA蛋白各处，若逐个分析这些点突变造成疾病的原因将需要生产40多个相应的MYH9基因原点突变小鼠，工作无疑极其繁巨。采用基因替代策略，将有效探讨、解决并回答上述问题。

发明内容

本发明旨在克服现有研究策略和技术方法的不足，提供一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述构架基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法包括如下步骤：

(1)构建mpNTKV-LoxP载体，所述mpNTKV-LoxP载体序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)在mpNTKV-LoxP载体基础上构建靶向MYH9基因的打靶载体：将小鼠MYH9基因外显子2上游4.0kb和下游1.7kkb DNA序列分别插入mpNTKV-LoxP载体中获得靶向MYH9基因的打靶载体，命名为mpNTKV-LoxP MAL-MAR靶向载体，所述mpNTKV-LoxP MAL-MAR靶向载体序列如SEQ ID NO.25所示；另外，所述mpNTKV-LoxP MAL-MAR靶向载体的同源臂序列由小鼠MYH9基因外显子2上、下游约6kb DNA序列组成，如SEQ ID NO.24所示；

(3)将拟替代内源MYH9基因的编码融合荧光蛋白的非肌性肌球蛋白重链II的cDNA(即mCherry-NMHC IIA,GFP-NMHC IIB,GFP-NHMC IIA R702C)分别插入靶向MYH9基因打靶载体中从而获得三个不同的MYH9基因替代打靶载体，这些打靶载体在本发明中分别命名为打靶载体1、2、3，如图2所示；它们的序列分别如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ IDNO.28所示；

(4)将构建的MYH9基因替代系列打靶载体分别通过电转导入小鼠ES细胞中，经药物筛选得到细胞单克隆，经Southern Blot或PCR鉴定细胞单克隆，进而获得MYH9基因替代ES细胞系，所述MYH9基因替代ES细胞系用于产生MYH9基因替代小鼠。

其中，步骤(4)中所述药物筛选是经G418和Ganciclovir药物筛选。

下面对本发明作进一步说明：

本发明的主要目的在于提供一种基于ES细胞构建基因替代小鼠研究野生型和突变体NMHC II功能的方法。主要包括：1)改造的mpNTKV-LoxP载体，具有更多的可供DNA片段插入的酶切位点，并且抗性基因Neomyocin两侧LoxP位点的加入，使得抗性基因的移除具有可能；2)构建靶向MYH9基因的打靶载体的左、右同源臂的DNA序列，使用这些DNA序列构建的打靶载体在小鼠ES细胞中进行MYH9基因替代打靶其同源重组效率高达90％以上；3)筛选与鉴定阳性ES细胞单克隆及小鼠基因型的Southern Blot探针和PCR引物。

首先，本发明利用所述序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对进行第一次PCR；在此基础上，利用序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的引物对进行第二次PCR。原载体pNTKV1905和第二次PCR产物分别经过酶切、DNA胶回收、连接、转化、质粒DNA制备，测序等步骤，结果证实载体改造成功，新载体命名为mpNTKV-LoxP，其图谱如图1所示，全序列如SEQ ID NO.4。此外，设计两对引物方便插入新载体两个多克隆位点的DNA片段测序，引物位置如图1所示，引物序列如SEQ ID NO.5、6、7、8所示。

其次，按照SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列信息，利用含小鼠MYH9基因的BAC DNA作模板分别进行PCR扩增左、右同源臂，再将左、右同源臂插入mpNTKV-LoxP质粒中，获得靶向MYH9基因的打靶载体如图2所示。右侧同源臂序列如SEQ ID NO.13所示，左侧同源臂序列如SEQ ID NO.14所示。在构建上述靶向载体基础上，将拟实施替代cDNA编码融合红色荧光蛋白(mCherry)的野生型NMHC IIA，或者cDNA编码融合绿色荧光蛋白(GFP)的NMHC IIB，或者cDNA编码融合绿色荧光蛋白R702C突变体NMHC IIA及SV40polyA终止序列插入左侧同源臂和抗性基因Neomyocin之间，从而获得三个不同的MYH9基因替代打靶载体，如图2所示。

第三，将线性化的打靶载体通过电转方法分别导入小鼠ES细胞，24小时后加入G418和Ganciclovir进行药物筛选一周，然后挑选ES细胞单克隆，并进行细胞扩增，提取基因组DNA用于筛选与鉴定。

第四，将从小鼠ES细胞中提取的全基因组DNA进行酶切、DNA胶分离、转膜，与经放射性同位素标记的左、右DNA探针杂交、洗膜和放射性自显影等Southern Blot过程，从而确定ES细胞单克隆是否为同源重组阳性。左、右侧探针位置如图2所示；PCR扩增左侧探针序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；PCR扩增右侧探针序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18。阳性细胞单克隆也可通过PCR利用SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20予以确定。此外，阳性细胞单克隆以及基因替代小鼠的基因型还可利用SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23引物通过PCR予以确定。

与现有技术和方法相比，本发明的优势在于：

1)mpNTKV-LoxP载体更方便DNA片段的插入从而有利于基因替代打靶载体的构建，通过三步克隆插入的DNA片段长度高达13kb，其中替代的cDNA片段达7kb，完全可以满足大多数基因插入要求，此外加入抗性基因Neomyocin两侧的LoxP位点可以根据需要，利用Cre实施对其切除。

2)利用小鼠MYH9基因第一个ATG上游4.0kb DNA序列和下游1.7kb DNA序列构建靶向载体的左、右同源臂，再将实施替代的cDNA编码野生型或突变体NMHC IIA或者cDNA编码NMHC IIB置于左侧同源臂和抗性基因Neomyocin之间，获得基因替代打靶载体。如此精巧安排使得内源MYH9基因被破坏而表达敲入的基因。最重要的是，利用这些打靶载体实现同源重组的效率高达90％以上，阳性ES细胞单克隆易于获得。

3)所提供的Southern Blot探针、PCR引物使得阳性细胞单克隆、小鼠基因型的筛选及鉴定更加灵活方便。

本发明构建了mpNTKV-LoxP载体，其经PCR、酶切及连接由pNTKV1905改造而成。新载体一个多克隆位点加入了Pac I、Nhe I、Swa I酶切位点，另一多克隆位点加入了Pme I酶切位点，并且抗性基因Neomyocin两侧分别加入了LoxP位点，这样使得该载体更有利于DNA片段依赖酶切位点的插入及抗性基因的后续移除。

构建了MYH9基因(其编码非肌性肌球蛋白重链IIA，Nonmuscle Myosin HeavyChain IIA,NMHC IIA)替代打靶载体，该载体包含4.0kb的MYH9基因第二号外显子上游序列的左侧同源臂、cDNA编码人类野生型或突变体NMHC II的表达盒、正抗性基因Neomyocin、1.7kb的MYH9基因第二号外显子下游序列的右侧同源臂，以及负抗性TK基因。

利用电转方法将经Not I线性化的基因替代打靶载体导入小鼠ES细胞中，经正、负标记药物筛选后，分离ES细胞单克隆，Southern blot或PCR鉴定证实发生同源重组的基因打靶效率超过90％。基于该方法获得多个(≥3)内源MYH9基因被人类野生型或突变体NMHCII替代的ES细胞系及相应的小鼠品系。因此，本发明所提供的载体、DNA序列、ES细胞单克隆筛选与鉴定的方法，为研究NMHC II基因家族正常或突变蛋白的功能提供了一种新的方法。

总之，本发明改造的mpNTKV-LoxP载体更适合于构建基因打靶载体特别是基因替代目的，新加入的Pac I和Swa I都是识别八个碱基的限制性内切酶，有利于较大DNA片段的插入。构建的MYH9基因替代打靶载体通过电转导入小鼠ES细胞中，经过药物筛选，ES细胞单克隆挑选，Southern Blot或PCR鉴定，发生同源重组的阳性单克隆细胞率高达90％以上，易于获得所需细胞系。使用阳性ES细胞显微注射至小鼠囊胚获得MY9基因替代嵌合体小鼠，并且该嵌合体小鼠可以交配传代，从而获得MYH9基因替代杂合子及纯合子后代。

附图说明

图1：mpNTKV-LoxP载体图谱及测序引物位置；

图2：MYH9基因替代打靶载体的构建示意图，Southern blot鉴定所用限制性内切酶、探针和PCR鉴定引物等位置，以及基因替代后的各突变等位基因；

图3：利用右侧探针进行Southern blot筛选小鼠胚胎干细胞单克隆以期获得突变A^mCh等位基因，野生型等位基因(A⁺)预期条带大小为9.7kb，突变型等位基因(A^mCh)预期条带大小为6.0kb；

图4：利用P4+P5引物对基因替代的A^mCh等位基因小鼠胚胎干细胞单克隆进行PCR验证，野生型等位基因(A⁺)无条带，突变型等位基因包括A^mCh以及A^b*和A^gfpR702C则可扩增出约2.0kb条带，ES细胞单克隆序号与Southern>

图5：利用P1+P2+P3引物对基因替代小鼠后代基因型进行PCR分析，野生型(A⁺)等位基因扩增出420bp条带，突变型等位基因(A^mCh、A^b*和A^gfpR702C)扩增出800bp条带；

图6：共聚焦显微镜揭示替代基因mCherry-NMHC IIA和GFP-NMHC IIB在A⁺/A^mCh和A⁺/A^b*小鼠胚胎干细胞分化而成的成纤维细胞中正确表达；

图7：R702C点突变NMHC IIA替代杂合子小鼠(A⁺/A^gfpR702C)表现与人类该基因位点突变一致的临床表型。与野生型小鼠(A⁺/A⁺)相比，A⁺/A^gfpR702C小鼠表现出巨大血小板(上图)和肾小球硬化(下图)。

具体实施方式

实施例1：质粒mpNTKV-LoxP的构建

为使原载体pNTKV1905(购自Stratagene)两个多克隆位点拥有更多的酶切位点，以及抗性基因Neomycin两侧加入LoxP位点，以pNTKV1905作模板利用正向引物mpN-LoxP-F5’-AGGAAGCTTGTTTAAACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCGAGGGGCGCGCCCCCAGCTGGTTCTTTCCGCC(SEQ>AGCCATATGATTTAAATGAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCATATGTGATCCCGGCGCGCCCTACCGGGTAGGGGAGGCGCTT(SEQID>AAGCTTGTTTAAACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCGAGGGGCGCGCCCCCAGCTGGTTCTTTCCGCC和反向引物mpN-LoxP-R25’-CGCGTCGACTCTAGGATCGATTCTAGCCGCGGCCCCCCGGGTGTAGTTAATTAAGCTAGCCATATGATTTAAATGAATTC(SEQ>

实施例2：靶向MYH9基因的打靶载体左、右同源臂的构建

从genome.ucsc.edu网站检索并下载获得小鼠MYH9基因组序列，结合小鼠MYH9mRNA(GenbankNo:NM_022410)序列，确定各外显子和内含子位置及序列，特别是含第一个ATG的外显子。根据MYH9第二号外显子(第一个ATG所处的外显子)上、下游各6kb基因组序列，利用Primer3软件设计4kb左右长臂和2kb左右短臂PCR引物，选取最佳序列。参照DavidJ.Adams 2005文献报道，获得包含整个MYH9基因的BAC Clone No:bMQ-369E5，并从Chieldren’hospotal Oakland Research Institute购买获得，BAC DNA利用QIAGENPlasmid Midi Kit(Qiagen)制备备用。以bMQ-369E5BAC DNA为模板利用正向引物MYH9Exon2R-F(Kpn I)5’-GGGGTACCGGCTCAGCAGGCTGCAGACAAGTACCTC(SEQ>GGATCCCAGCGGGGTAGGAAGCACGATG(SEQ>GTCGACGAAGTGAAGCTCCTGGCTTTG(SEQ>CCGCGGGTGACTTGCGGCCAGGACCTAAG(SEQ>

实施例3：基因替代打靶载体的构建

从mpmCherry NMHC IIA(人类野生型MYH9cDNA)、mpEGFP NMHC IIB(人类野生型MYH10cDNA)，或mpEGFP NMHC IIA(人类R702C点突变MYH9cDNA)质粒中利用Pac I和Pme I将N端融合mCherry的NMHC IIA，N端融合GFP的NMHC IIB或R702C NMHC IIA cDNA，以及SV40polyA完整表达盒切出(这些质粒为本实验室已经构建，mCherry或GFP5’端含有Pac I酶切位点，SV40polyA 3’端含有Pme I酶切位点)，同时利用Pac I和Swa I对mpNTKV-LoxPMAL-MAR质粒进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出目的条带并回收，然后载体与目的片段连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示替代基因表达盒成功插入至左侧同源臂与抗性基因Neomycin之间，至此表明完整的MYH9基因替代打靶载体构建完毕，分别称为打靶载体1、2、3，其所产生的相应突变等位基因分别命名为A^mCh，A^b*，A^gfpR702C，野生型则为A⁺，如图2所示。

利用Not I将各基因替代打靶载体(100μg)线性化，然后使用UltraPurePhenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol(25:24:1,v/v)(Invitrogen)抽提DNA线性化酶切体系两次，高速离心10min后将上清转移至另一新的1.5ml EP管，加入2.5倍上清体积的100％乙醇，充分混合后高速离心10min获得白色DNA沉淀，然后用70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，在超净台中去除上清并风干DNA沉淀约10min，待乙醇溶液完全风干后，加入适量TE溶液溶解DNA约2小时以上，测定线性化DNA浓度并调节DNA浓度约为1μg/μl，同时利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，DNA溶液4℃保存备用。

实施例4：基因替代打靶载体电转至小鼠ES细胞中

γ-射线处理的抗Neomycin(Neomycin-resistant)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)用作滋养层细胞和V6.5小鼠胚胎干细胞系(C57BL/6和129S6vEv杂合遗传背景)来自美国国立心肺血液研究所转基因中心。10cm细胞培养皿用3ml 0.1％Gelatin于37℃包被2小时备用，然后加入2X10⁶Neomycin-resistant>7个细胞/ml浓度重悬于电转缓冲液中(Millipore)。取0.6ml细胞加入含50μg线性化打靶载体DNA的1.5ml>2培养箱中培养。24小时后，换成含800μg/ml>2培养箱中培养。24小时后，用胰酶消化挑取的单克隆细胞并吹打6次，再转移至新的事先准备好的含滋养层细胞及培养液的48孔培养板中，于37℃>2培养箱中培养3-4天，每天换液。待单克隆细胞长至80％丰度，细胞经胰酶消化、吹打、培养基中和后，将1/3细胞悬液转移至事先准备好的含滋养层细胞及培养液的24孔培养板中，并于37℃>2培养箱中培养至细胞丰度达90％，用于制备基因组DNA；向剩余在48孔培养板的细胞悬液中加入等体积的2X胚胎干细胞冻存液(Millipore)，用Parafilm封好培养板四周再包裹两层以上吸水纸，储存在-80℃冰箱备后续利用。

实施例5:MYH9基因替代胚胎干细胞单克隆的筛选与鉴定

小鼠胚胎干细胞基因组DNA制备：移去培养在24孔板中的经药物筛选的ES单克隆细胞的培养液，PBS洗涤一次，加入600μl含RNaseA的Nuclei lysis solution(Promega)，反复吹打并转移至一干净EP管中，加入200μl Protein precipitation solution，有力地Vortex半分钟后，置于冰上放置5min，然后高速离心10min，转移上清至另一新EP管，加入等体积的Isopropanol并混匀，室温高速离心10min后，去除上清，用1ml 70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，再高速离心5min后，用真空泵吸去上清，室温风干10-15min，最后加入100μl DNARehydration solution，于4℃溶解过夜并保存备用。

Southern Blot探针制备：以bMQ-369E5BAC DNA为模板利用正向引物LP-F5’-GGATTGAACCTGAGGCTTTG(SEQ ID NO.15)和反向引物LP-R 5’-GAGGAGGAGTGCTTGCTGTG(SEQID NO.16)及Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity作PCR扩增约1.2kb左侧探针(94℃ 2min,94℃ 30s,55℃ 30s,68℃ 80s,30cycles,68℃ 10min)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出目的条带并回收，然后将目的片段与T-easy载体(Promega)连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示左侧探针构建成功命名为LP。与上述方法类似，以bMQ-369E5BAC DNA为模板利用正向引物RP-F 5’-TTTACCCACTGACTCATACCTC(SEQ ID NO.17)和反向引物RP-R 5’-TGTGTTCTCCCTCCAATTACTC(SEQ ID NO.18)及Platinum Taq DNA Polymerase HighFidelity作PCR扩增约1.6kb右侧探针(94℃ 2min,94℃ 30s,55℃ 30s,68℃ 100s,30cycles,68℃ 10min)。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切出目的条带并回收，然后将目的片段与T-easy载体连接，接着转化至大肠杆菌DH5α，挑取单个菌落培养，提取质粒DNA，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示右侧探针构建成功命名为RP。

Southern blot检测：利用Dra I限制性内切酶(购自Fermantas)将10-15μg基因组DNA于37℃酶切过夜，0.8％琼脂糖凝胶25V低电压电泳过夜分离。DNA gel分别依次经0.2NHCL、变性和中和液(Sigma)浸泡20min后，利用Nytran Supercharge Turboblotter(Schleicher&Schuell Bioscience)和20XSSC缓冲液(Sigma)进行DNA印记转膜，转膜完毕后取出膜于2XSSC溶液中浸泡10min，接着利用UV light进行交联。与此同时，利用EcoR I(Fermantas)将DNA探针从T-easy载体切出并对探针片段做DNA胶回收纯化，利用Ready-to-go DNA Labeling Beads(Amersham)和³²P>+，A^mCh,A^b*和A^gfpR702C各等位基因的预期条带大小分别为9.7kb,12.1kb，8.5kb，12.1kb。利用右侧探针进行Southern>+，A^mCh,A^b*和A^gfpR702C各等位基因的预期条带大小分别为9.7kb，6.0kb，6.0kb，6.0kb，如图3所示。Southern>