阿米洛利降低蛋白尿的实验研究

摘要

背景：蛋白尿是肾脏疾病主要的临床表现之一,也是肾脏病持续性进展的重要因素。一系列大型临床研究均证实:蛋白尿的多寡以及持续时间均直接关系肾脏疾病的预后。足细胞作为肾小球固有细胞之一,附着于肾小球基底膜(glomerularbasement membrane,GBM)的外侧,与肾小球基底膜以及毛细血管内皮细胞构成肾小球的滤过屏障。作为肾小球血液滤过的最后屏障,足细胞(podocyte)的改变几乎参与了所有的蛋白尿相关性肾病的发生,并在蛋白尿相关性肾脏疾病发展进程中起着关键作用。足细胞已经成为针对蛋白尿研究的关键细胞,阐明足细胞损伤的分子机制具有重要意义。
　　 目前对足细胞分子结构的研究主要集中在①裂孔隔膜复合体(SDs)区,包括:nephrin、podocin、ZO-1,CD2AP,P-cadherin,FAT等；②顶端膜蛋白区:Podocalyxin、GLEPP-1；③基底膜相接触的基底蛋白区:α3β1整合素、Dystroglycan(DG)；④足细胞骨架蛋白:synaptopodin、α-actinin-4、F-actin等。然而遗憾的是,尽管通过一些单基因或遗传性肾病综合征的研究,对足细胞结构的认识有了很大进展,但对足细胞损伤机制的认识仍未取得重大进展。目前,临床上蛋白尿的治疗缺乏直接针对靶细胞-足细胞损伤分子机制的治疗。
　　 最新研究(Nat Med,2008)发现:在人类肾小球疾病、PAN肾病动物模型以及LPS诱导的蛋白尿动物/细胞模型中,尿激酶受体(urokinase receptor,uPAR)表达增加可导致足细胞活动增强并导致蛋白尿的产生。uPAR一种糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白,能与一些跨膜蛋白如整合素、小窝蛋白等结合形成信号复合体,在炎症、肿瘤浸润和转移起着重要作用。研究进一步发现:基因敲除uPAR(plaur-/-)小鼠同时予LPS处理,明显减少蛋白尿发生；转入表达的uPAR(plaur cDNA)并予LPS处理,可以让已经敲除uPAR基因的小鼠(plaur-/-)重新出现蛋白尿；这一发现证明:uPAR的表达增加,可以导致蛋白尿的发生。由此可见:足细胞上uPAR是蛋白尿发生机制中有着其独特作用。
　　 阿米洛利(amiloride)是一种Na通道阻滞剂,已作为利尿药在临床上使用。有研究提示:在克隆的肿瘤细胞株,amiloride可以从mRNA及蛋白两个水平,抑制其uPAR的表达,从而降低细胞的活动力。那么,在足细胞上,amiloride是否能抑制uPAR的表达,降低足细胞的活动力呢?由此,本研究提出这样的假设,在损伤足细胞及蛋白尿动物模型上,amiloride能通过抑制uPAR的表达,同时降低足细胞活动力,稳定足细胞,以期达到降蛋白尿的作用。为了验证上述假说本研究通过建立脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型和经典的5/6肾切除大鼠模型蛋白尿模型以及体外脂多糖诱导足细胞损伤模型,分别从体内及体外实验,RNA及蛋白质两个水平观察阿米洛利对uPAR表达的影响,初步探讨阿米洛利的降蛋白尿的作用机制,拟为未来在针对足细胞靶细胞水平上治疗蛋白尿提供一种新的治疗药物。
　　 方法：
　　 一、建立脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型和经典的5/6肾切除大鼠模型蛋白尿模型,观察阿米洛利对蛋白尿的影响
　　 (一)脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型制作:18只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常对照组(Con)、LPS处理组(LPS)、LPS与amiloride共同处理组(LPS+amiloride),每组6只。LPS组及LPS+amiloride组腹腔注射LPS200ug,Con组给予等量生理盐水腹腔注射,LPS+amiloride组提前二天给予amiloride10mg·kg-1·d-1灌胃,Con组及LPS组每天给予等量生理盐水灌胃。
　　 (二)5/6肾切除大鼠模型的制作:43只SD雄性大鼠随机分为假手术对照组(Sham)14只、5/6肾切除组(NTX)14只、5/6肾切除+amiloride干预组(NTX+amiloride)15只。NTX+amiloride组行5/6肾切除手术,一周后每日给予amiloride3mg·kg-1灌胃,NTX组行5/6肾切除手术,一周后每日给予等量生理盐水灌胃,Sham组行假手术,一周后每日给予等量生理盐水灌胃。
　　 (三)时间点设置及24小时尿蛋白检测:脂多糖诱导小鼠蛋白尿模型于第3天留取24h尿液检测蛋白浓度后处死并留取肾组织,5/6肾切除大鼠模型分别于2周、4周、8周、12周留取24小时尿液检测尿蛋白量后处死并取肾组织。
　　 二、观察阿米洛利对足细胞活动力的影响
　　 (一)足细胞培养:条件永生性小鼠足细胞由Baylor医学院Danesh教授惠赠。首先在5％CO2,33℃培养箱环境,用含20—100U·mL-1IFN-γ的RPMI1640和10％FBS放入Ⅰ型胶原包被的培养瓶中共孵育,使其获得增殖能力。然后转入5％CO2,37℃培养箱,用不含IFN-γ的DMEM加10％FBS共孵育,经10-14天的培养诱导,足细胞进入分化阶段并最终分化成熟。
　　 (二)足细胞鉴定及形态学观察:分别对33℃含IFN-γ培养及37℃不含IFN—γ培养10-14天分化成熟后的足细胞在相差显微镜下直接拍片,观察其形态学差异；免疫荧光采用表达足细胞骨架蛋白synaptopodin的细胞为分化成熟的足细胞,未分化的足细胞不表达synaptopodin蛋白。
　　 (三)按以下分组干预处理足细胞:
　　 1)正常对照组(Con):不加任何干预因素分化成熟的足细胞；
　　 2)LPS组(LPS):50·mg·L-1脂多糖与成熟足细胞共同孵育24h；
　　 3)LPS与amiloride共同干预组(LPS+amiloride):用50·mg·L-1脂多糖分别与50·mg·L-1阿米洛利共同干预24h；
　　 (四)转板迁移测定法(Transwell migration assay):使用龙胆紫染色后,在倒置显微镜下摄片,观察Con组、LPS处理组及LPS与amiloride共同干预组足细胞迁移的变化。
　　 (五)刮除法(Wound healing assay):在Ⅰ型胶原包被的六孔板爬片上培养细胞后,刮除细胞后给予不同的处理,24小时后观察Con组、LPS处理组及LPS与amiloride共同干预组足细胞损伤修复的变化情况。
　　 三、阿米洛利对足细胞uPAR表达的影响
　　 (一)脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型和经典的5/6肾切除大鼠模型蛋白尿模型,观察阿米洛利对uPAR表达的影响
　　 1)行两种动物模型中肾组织冰冻切片,并免疫荧光激光共聚焦观察synaptopodin、uPAR表达。
　　 2)提取两种动物模型中肾脏组织mRNA,real-time PCR检测各组plaurmRNA表达。
　　 (二)体外实验观察观察阿米洛利对uPAR表达的影响
　　 1)观察阿米洛利对足细胞uPAR mRNA(plaur mRNA)表达影响:将上述各实验分组提取细胞RNA后,并用real-time PCR检测各组plaur mRNA表达。
　　 2)观察阿米洛利对足细胞uPAR蛋白表达影响
　　 ①通过流式细胞术检测上述实验分组uPAR蛋白的表达；
　　 ②运用免疫荧光检测Con组、LPS组、LPS与amiloride共同干预组uPAR蛋白表达；
　　 四、统计学处理计量资料数据以均数±标准差((X)±S)表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,结果用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齐性用LSD法进行组间多重比较,方差不齐用Dunnett's T3法进行组间多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 一、阿米洛利可以降低脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型和5/6肾切除大鼠蛋白尿模型中的蛋白尿
　　 (一)脂多糖诱导小鼠短暂蛋白尿模型中各组蛋白尿的变化:
　　 与Con组相比较,LPS组24小时蛋白尿明显升高[(4.12±1.06)mg vs(1.35±0.68)mg；p=0.000],有统计学意义；而与LPS组相比较,LPS+amiloride组尿蛋白明显降低[(4.12±1.06)mg vs(1.99±0.96)mg；p=0.001],有统计学意义；LPS+amiloride组24蛋白尿与Con组相比无统计学意义(p=0.244)。
　　 (二)SD大鼠5/6肾切除模型各组尿蛋白变化:
　　 第2周时,与假手术对照组(Sham)相比较,5/6肾切除组(NTX)24小时尿蛋白明显升高[(47.50±28.05)mg vs(14.28±3.8)mg,P=0.023],有统计学意义；与NTX组相比,5/6肾切除并用amiloride干预组(NTX+amiloride)24小时尿蛋白无统计学意义[(51.56±21.03)mg vs(47.50±28.05)mg,P=0.748]。第4周时,与Sham组及NTX+amiloride组相比较,NTX组24小时尿蛋白无明显升高[(50.09±22.34)mg vs(21.77±5.29)mg,P=0.112；(50.09±22.34)mg vs(33.52±10.11)mg,P=0.411],无统计学意义。第8周时,与NTX组[(162.39±27.62)mg]相比,NTX+amiloride组[(109.22±31.26)mg]、sham组[(19.38±8.26)mg]24小时尿蛋白增加量均明显较低,有统计学意义[P值分别为0.004,0.000]。第12周时,与NTX组[(188.31±29.82)mg]相比,NTX+amiloride组[(121.37±31.14)mg]、sham组[(21.32±8.59)mg]24小时尿蛋白增加量均进一步减少,具有统计学意义[P值分别为0.001,0.000]。
　　 二、足细胞形态学观察及鉴定结果足细胞在33℃含IFN-γ培养基下培养,呈鹅卵石样或树枝样交错排列,为增殖状态的足细胞；在37℃无IFN-γ条件下培养10-14天后,足细胞分化成熟,胞体变大,胞质变淡,呈云朵状,分出许多初级及次级足突相互交错,为分化状态的足细胞；33℃ IFN-γ培养条件下足细胞处于增殖状态,不表达足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin；而37℃无IFN-γ条件下培养10天分化成熟后的足细胞表达足细胞特异性骨架蛋白synaptopodin,可见细胞内拉丝状细胞骨架。
　　 三、阿米洛利对足细胞活动力的影响
　　 (一)转板迁移测定法(Transwell migration assay):
　　 在Con组、LPS组及LPS+amiloride组,平均每个视野细胞数分别为(248.75±10.11)、(324.25±14.97)和(274.5±8.35)个,LPS组迁移细胞数明显多于其他2组,有统计学意义(均P=0.000)。
　　 (二)刮除法(Wound healing assay):
　　 为了更直接的分析各实验组足细胞的活动力改变情况,我们采用刮除法来检测足细胞的损伤修复能力,结果发现24小时后划痕内正常对照组、LPS组及LPS+amiloride组分别为(15±4.74)、(42.6±6.88)和(18.4±6.35)个,LPS组刮除后的足细胞细胞损伤修复比Con组和LPS+amiloride组明显增加(均P=0.000),有统计学意义；而LPS+amiloride组与Con组相比无统计学意义(P=0.392)。
　　 四、阿米洛利对足细胞uPAR表达的影响
　　 (一)阿米洛利可以抑制LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型及5/6肾切除模型足细胞uPAR表达:
　　 1)阿米洛利可以抑制两种模型足细胞uPAR蛋白表达激光共聚焦显微镜观察,在LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型上,Con组足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin主要表达于肾小球足细胞,uPAR广泛存在于肾小管和小球,二者很少在肾小球足细胞上融合；而LPS组可见uPAR表达增加,荧光亮度较高,与足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin在肾小球足细胞上广泛融合；在LPS+amiloride组明显可见uPAR表达下调,荧光亮度降低,与足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin在肾小球足细胞上融合减少。
　　 同样在5/6肾切除模型上,NTX组可见uPAR表达增加,荧光亮度较高,与足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin在肾小球足细胞上广泛融合；与NTX组相比,sham组及NTX+amiloride组,明显可见uPAR表达下调,荧光亮度降低,与足细胞特异性骨架蛋白Synaptopodin在肾小球足细胞上融合减少。
　　 2)阿米洛利可以抑制两种模型PLAUR mRNA表达在LPS诱导小鼠短暂蛋白尿模型上,与con组相比较,LPS组PLAUR mRNA表达明显增高,(2.12±0.35 vs1.04±0.14,P=0.000),有统计学意义；与LPS组相比较,LPS+amiloride组PLAUR mRNA表达下调(2.12±0.35 vs1.30±0.22,P=0.000),有统计学意义。
　　 在5/6肾切除模型上,与sham组相比较,NTX组PLAUR mRNA表达明显增高(9.74±1.44 vs1.01±0.13,P=0.000),有统计学意义；与NTX组相比较,NTX+amiloride组PLAUR mRNA表达下调(9.74±1.44 vs5.01±1.36,P=0.000),有统计学意义。
　　 (二)体外实验中,阿米洛利可以足细胞uPAR的表达
　　 1)阿米洛利对足细胞PLAUR mRNA的影响:定量PCR检测足细胞PLAURmRNA表达,LPS组PLAUR mRNA显著高于Con组(2.41±0.32 vs1.00±0.00,P=0.000)及LPS+amiloride组(2.41±0.32 vs1.33±0.21,P=0.01),有统计学意义。
　　 2)阿米洛利对足细胞uPAR蛋白的影响:利用免疫荧光共聚焦技术检测各实验分组足细胞uPAR蛋白表达,LPS组uPAR蛋白荧光信号明显强于正常对照组和LPS+amiloride组,正常对照组与LPS+amiloride组荧光信号无明显差异。采用流式细胞术检测各组足细胞uPAR蛋白表达,Con组、LPS组及LPS+amiloride组uPAR蛋白表达率分别为(10.34±3.25)％,(50.74±6.78)％及(29.97±10.26)％;LPS组uPAR蛋白表达率明显高于Con组(P=0.001)及LPS+amiloride组(P=0.014),有统计学意义。
　　 结论：
　　 一、在LPS诱导小鼠蛋白尿模型及5/6肾切除大鼠蛋白尿模型两种经典蛋白尿模型中,阿米洛利具有降低蛋白尿作用；
　　 二、阿米洛利可以通过降低受损足细胞活动力,起到稳定足细胞,从而防止足细胞受损；
　　 三、阿米洛利可以通过抑制受损足细胞uPAR的表达,降低损伤的足细胞活动力,稳定足细胞,从而起到降蛋白尿的作用。