肌苷产生菌的选育及其发酵条件研究

摘要

本文以代谢控制发酵理论为指导,重点研究了肌苷高产菌的选育及其发酵条件.主要研究内容和结果如下:1.建立了发酵液中肌苷定量测定的方法--离子交换法,对其最佳分离条件进行了研究,并与纸层析法进行比较,发现该方法准确度和精确度比纸层析方法高,可用于简单条件下对肌苷发酵液中目的产物的测定.2.以枯草芽孢杆菌TY-21为出发菌株,通过硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育出一株肌苷产生菌TX-3,其遗传标记为腺嘌呤缺陷、硫胺素缺陷、8-氮鸟嘌呤抗性和磺胺胍抗性(Ade<'->+Thi<'->+8-AG<'r>+SG<'r>).在未经优化的摇瓶发酵条件下可产肌苷12.41g/L.3.研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TX-3摇瓶发酵生产肌苷的最佳条件.通过均匀设计和模式识别方法分别研究了肌苷种子和发酵培养基的最佳配比.在最佳条件下,摇瓶分批发酵产量为18.94g/L.同时采用流加方式研究了摇瓶补料分批发酵条件,该条件下肌苷产量可达到24.79g/L.4.利用5L罐分批发酵数据,对发酵过程进行了代谢流分析.基于物流平衡原理,初步进行了发酵过程的代谢流分析;结合发酵过程曲线分析了肌苷发酵全程代谢行为;应用TX-3菌株的代谢流量平衡模型计算出了肌苷发酵中后期的代谢流分布并通过MATLAB软件线性规划得到理想代谢流分布,结果表明尽量降低EMP途径的代谢通量有利于肌苷的合成,提高肌苷合成途径中各关键酶的活力可有效增加肌苷的生成量,减少副产物的生成和提高发酵过程溶氧水平均可增加肌苷合成代谢流.

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1肌苷的理化性质

1.2肌苷的用途

1.3肌苷的测定方法

1.3.1离子交换法分离测定肌苷

1.3.2高压液相色谱法分离测定肌苷

1.3.3酶法分析测定肌苷

1.3.4纸层析法分离测定肌苷

1.3.5电泳法测定肌苷

1.3.6薄层层析法分离测定肌苷

1.4肌苷的生产方法及生产概况

1.4.1肌苷的生产方法

1.4.2肌苷的生产概况

1.5肌苷的生物合成途径及其代谢调节机制

1.5.1肌苷的生物合成途径

1.5.2肌苷合成的代谢调节机制

1.6肌苷产生菌育种思路

1.6.1选择5'-核苷酸酶活力强的菌株

1.6.2切断支路代谢

1.6.3解除菌体自身的反馈调节

1.6.4增加前体物的合成

1.6.5肌苷产生菌育种实例

1.7代谢工程与肌苷工程菌的构建

1.7.1基于代谢工程理论的肌苷工程菌构建的具体思路

1.7.2肌苷工程菌的构建

1.8肌苷的发酵控制

1.8.1碳源和氮源对产苷的影响

1.8.2无机盐及生长因子对产苷的影响

1.8.3温度、pH对产苷的影响

1.9菌种保藏

1.10论文立题背景及主要研究内容

2.材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器

2.1.2主要试剂

2.1.3培养基

2.1.4主要溶液

2.2实验方法

2.2.1发酵液中肌苷的分离与测定方法

2.2.2肌苷生产菌的诱变育种方法

2.2.3肌苷生产菌摇瓶发酵方法

2.2.4肌苷生产菌5L罐发酵方法

2.2.5分析方法

3.结果与讨论

3.1发酵液中肌苷的分离与测定方法

3.1.1纸层析法测定

3.1.2离子交换法测定

3.1.3与纸层析测定方法的比较

3.2肌苷产生菌的诱变育种

3.2.1出发菌株的选择

3.2.2出发菌株的遗传标记验证

3.2.3菌体生长曲线的绘制

3.2.4 DES诱变条件的选择

3.2.5磺胺胍抗性突变株的筛选

3.2.6 TX-3遗传稳定性测定

3.2.7小结

3.3肌苷摇瓶发酵条件的研究

3.3.1模式识别优化方法

3.3.2种子培养基的均匀设计法优化

3.3.3种子培养条件的优化

3.3.4发酵培养基的优化

3.3.5分批发酵条件的优化

3.3.6补料分批发酵条件的优化

3.3.7小结

3.4 5L罐分批发酵过程的代谢流分析

3.4.1代谢平衡方法及其理论基础

3.4.2肌苷产生菌枯草芽孢杆菌TX-3代谢网络及代谢流平衡模型的建立

3.4.3肌苷分批发酵过程曲线及全程代谢分析

3.4.4分批发酵过程产物代谢速率参数的确定

3.4.5肌苷发酵中后期的代谢流分析

3.4.6 小结

3.4.7附录——化学计量平衡式

4.结论

4.1建立了发酵液中肌苷定量测定方法——离子交换法

4.2以枯草芽孢杆菌TY-21为出发菌株，通过诱变方法选育出一株肌苷产生菌TX-3

4.3研究了菌株TX-3的摇瓶分批发酵条件

4.4利用5 L罐分批发酵数据，对肌苷发酵过程进行了代谢流分析

5.展望

参考文献

研究生期间发表论文情况

致谢