Bacillus subtilis肌苷高产菌株选育及全合成培养基发酵生产肌苷研究

摘要

本文以B.subtilis HSD060为出发菌株，注入不同剂量N+离子束，定向筛选磺胺胍抗性(SG')、阿拉伯糖利用缺陷株(ara)单突变株，对正变株进行复筛得到两株肌苷产量显著提高的单突变株B13(SGr)和B67(ara)，产苷能力分别达到14.83g/L和15.3 g/L，比出发菌株产量分别提高了16-3％和19.97％。结果表明3×1015 ions/cm2照射剂量是获得Bacillus subtilis HSD0.SGr突变株和产量正变株的最佳剂量，高照射剂量下SGr突变率下降，并且容易导致突变株肌苷产量下降；低处理剂量和较低的致死率，对于筛选阿拉伯糖利用缺陷正变株更有效，2×1014 ions/cm2左右的诱变剂量是最合适的剂量。 以菌株B13和B67为处理菌株材料，照射剂量分别采用2×1014、1×1016和8×1014、3×1015 ions/cm2，分别筛选ara突变、SGr突变，经过复筛得到产量明显提高的双突变株B13-5、B13-105和B67-1。双突变株的筛选结果显示，采用离子束诱变发生SGr突变的频率仍然高于ara突变率。对于B67菌株，3×1015ions/cm2处理剂量时发生SGr突变的频率较高。高产双突变菌株B67-1平均摇瓶发酵产苷达到18.84 g/L，比出发菌株B67和B.subtilis HSD060分别增产23.14％和47.76％。平板法测定B67-1对磺胺胍的抗性，其最高浓度提高到了600mg/L，ara突变标记仍然存在。B13菌株发生ara突变均为处理强度较高的1×1016ions/cm2处理组，2×1014ions/cm2处理组未获得ara突变子。高产双突变菌株B13-105和B13-5平均产苷分别达18.31g/L、17.85g/L，比出发菌株B13分别增产23.5％和20.4％，比B.subtilis HSD060分别增产43.61％、40.0％。平板法测定B13-105和B13-5对磺胺胍抗性和阿拉伯糖利用能力，结果表明其抗性仍然保持原来水平，新获得了ara突变标记。离子注入筛选双突变菌株的研究为肌苷菌种的改造开辟了一条新的途径，并为进一步的选育工作在实验方法和选育条件方面奠定了工作基础。 肌苷发酵天然培养基中酵母粉和玉米浆成分复杂，无法直接设计出合理的合成培养基配方，故将目前发酵生产所用的优化天然培养配方中的酵母粉和玉米浆成分去除，加入维生素、碱基、氨基酸混合物，得到全合成培养基，并通过发酵试验进行合成培养基的优化。混合氨基酸、碱基、维生素按不同的组合方式进行试验，并通过正交试验确定了最适用量分别为30、2、0.15mg/100mL时，平均产苷2.91.g/L。优化维生素混合组分中各单因素配合比例增加了肌苷产量，平均产苷3.27g/L；优化碳氮比为8时，平均产苷4.02g/L，有效的提高了肌苷产量。 全合成培养基中限制因子Ade和Thi分别为4mg/100mL、0.15mg/100mL时，有利于肌苷积累，产苷达4.21g/L。8种必需氨基酸的添加优于8种非必需氨基酸对产苷的影响；高浓度的苯丙氨酸可代替异亮氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸等七种氨基酸促进肌苷积累，全合成培养基中(苯丙氨酸+组氨酸)浓度为50mg/100mL时，产苷达4.69g/L。嘌呤的添加优于嘧啶对产苷的影响；次黄嘌呤适量添加可作为补救途径积累肌苷，浓度为5mg/100mL时，产苷达4.07g/L。氨基酸混合液重要成分对产苷的贡献不同。VB2浓度为0.05mg/100mL时，产苷4.75g/L；(叶酸+肌醇+烟酸)浓度为0.15mg/100mL时，产苷4.34g/L；VH浓度为0.15 mg/100mL时，产苷4.14g/L。作为肌苷发酵的重要调控因子之一，Mn2+限量添加，能保证细胞膜的良好渗透性，对肌苷发酵有促进作用，Mn2+浓度为0.01mg/100mL时，产苷4.06g/L。 将混合氨基酸、碱基、维生素中关键成分进行七因素三水平正交试验，当VB2为0.01，(6-氯嘌呤+2，6-二氯嘌呤)2，(苯丙氨酸+组氨酸)35，粗次黄嘌呤0.1，VH0.2，Mn2+0.01，(烟酸+肌醇+叶酸)0.2 mg/100mL，时，有最大产苷量。以此组合作为最终全合成培养基配方，进行5个摇瓶重复发酵试验，平均产苷5.04g/L，是基础培养基配方产苷量(0.45 g/L)的5.4倍。研究结果表明用已知维生素、碱基、氨基酸混合物取代发酵培养基中酵母粉和玉米浆，通过培养基优化，确定合成培养基中每一种已知成分的用量和比例，实现对肌苷发酵和精确控制，充分发挥高产菌株的生产能力，能大幅度提高肌苷发酵产量。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1肌苷的生产状况

1.1.1国外肌苷生产状况

1.1.2国内肌苷生产状况

1.2肌苷的生物合成途径及其代谢调节机制

1.2.1肌苷的生物合成途径

1.2.2肌苷合成的代谢调节机制

1.3肌苷菌种选育

1.3.1肌苷菌种的选育思路

1.3.2离子注入诱变手段的优点和研究现状

1.3.3全合成培养基发酵生产肌苷

1.4论文选题依据与意义

1.4.1利用单突变筛选双突变高产菌株

1.4.2全合成培养基精确控制发酵生产肌苷

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

2.1.2主要仪器

2.1.3主要试剂

2.1.4主要溶液

2.1.5培养基

2.2实验方法

2.2.1发酵液中肌苷的分离与测定方法

2.2.2离子注入诱变及肌苷高产菌的筛选方法

3结果与讨论

3.1离子注入诱变处理筛选单突变株

3.1.1离子束照射剂量与B.subtilis HSD06存活率的关系

3.1.2磺胺胍抗性突变株(SGr)的筛选

3.1.3阿拉伯糖利用缺陷突变株(ara)的筛选

3.2离子注入筛选双突变株

3.2.1以SGr突变株为出发菌株筛选带有ara标记的双突变菌株

3.2.2以ara突变株为出发菌株筛选带有SGr标记的双突变菌株

3.2.3双突变高产菌株稳定性考察

3.3全合成培养基肌苷发酵设计与优化

3.3.1混合氨基酸、维生素、碱基之间配比优化

3.3.2合成培养基中碳氮源优化

3.3.3三类营养物中关键成分分析及对产苷的贡献

3.3.4合成培养基简化设计

4结论

4.1 B.subtilisHSD06细胞对离子束照射的敏感性与抗性

4.2 SGr突变株的筛选与高产菌株选育

4.3 ara突变株的筛选与高产菌株选育

4.4双突变菌株筛选高产菌株选育

4.5氨基酸、碱基、维生素混合组分浓度水平

4.6混合氨基酸、碱基、维生素中的关键成分

4.7氨基酸、碱基、维生素中关键成分的最适浓度

参考文献

论文发表、录用情况

致谢