尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶的分离纯化及性质研究

摘要

葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase，EC1.1.3.4，简称GOD)在食品、医药及生物等领域有着广泛的应用。以尼崎青霉菌(Penicilliumamagasakiense)为材料，采用发酵生产葡萄糖氧化酶，探讨不同时间、温度、转速、Ca2+、吐温80等对菌丝体和发酵液产酶的影响。24℃、200rpm、发酵六天、0.3mol/L的Ca2+、3％的吐温80的条件下，菌丝体和发酵液中总酶活力达到最大。发酵6天后，离心得菌丝体经破壁、缓冲液抽提，获得胞内葡萄糖氧化酶的粗酶液；发酵液即为胞外葡萄糖氧化酶的粗酶液。胞外葡萄糖氧化酶粗酶液浓缩后，采用DEAE-32离子交换柱层析、SephacrylS-200分子筛凝胶过滤柱层析纯化，得到比活力为比活力达472U/mg，纯化了29.7倍的的电泳单一纯的酶制剂，该酶的亚基分子量约为75kD。 该酶催化化葡萄糖反应的最适pH值为5.6，最适温度40℃，在pH7.0，37℃条件下测得动力学，米氏常数Km值为122.6mmol/L，Vm为25.52μmol/(L·min)。酶的热稳定性研究表明：该酶在pH5.5～8.5区间和在温度低于50℃下稳定。化学修饰剂对酶活力的影响表明咪唑基、吲哚基、精氨酸胍基是该酶的活性功能基团，而蛋白质分子中巯基、二硫键、赖氨酸的ε-氨基、蛋氨酸侧链的硫醚基和丝氨酸残基与酶活力无关。溴代乙酸(BrAc)、NBS的抑制机理为非竞争性类型，而乙酰丙酮其抑制机理表现为竞争性类型。它们的抑制常数分别为26.5、19.2、7.35mmol/L。金属离子对酶活力的影响表明金属离子(Li+、Na+、K+、Ca2+、Mn2+)对酶活力也没有影响。Al3+和Zn2+对GOD具有轻微的激活作用：Ba2+、Co2+、Cd2+对酶有轻微抑制作用；Cu2+、Ag+对该酶的抑制机理表现为竞争性类型，Hg2+的抑制机理表现为非竞争性类型。其抑制常数(KI)分别为10.78μmmol/L，0.065μmol/L和83.1μmol/L。有机溶剂对酶活力的影响表明甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇对酶基本没有影响。甲醛对酶也都具有强烈的抑制作用，其半抑制浓度(IC50)分别为81.25mmol/L。甲醛的抑制机理表现为竞争性类型，其抑制常数(KI)为30mmol/L。变性剂对酶活力的影响：EDTA对酶基本上没有影响，脲对该酶有轻微的抑制作用。盐酸胍、SDS对酶有强烈的抑制作用，其抑制机理表现为竞争性类型，其抑制常数(KI)分别为1.75、57.15mmol/L。

目录

文摘

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第一章前言

1.1葡萄糖氧化酶简介

1.1.1葡萄糖氧化酶催化反应

1.1.2葡萄糖氧化酶分子组成及其作用机制

1.2葡萄糖氧化酶的生产

1.2.1葡萄糖氧化酶的生产菌

1.2.2葡萄糖氧化酶生产营养要求

1.2.3控制条件

1.3葡萄糖氧化酶在生产中的应用

1.3.食品工业

1.3.2医药工业

1.3.3生物方面

1.3.4其他方面

1.3.5葡萄糖酸的应用

1.4国内外研究现状及进展

1.4.1关于葡萄糖氧化酶活力测定的研究

1.4.2酶制剂研究进展

1.4.3酶固定化及分子水平的研究

1.5本课题的研究意义与研究内容

第二章实验材料、仪器与方法

2.1实验材料

2.2仪器

2.3试剂处理

2.4方法

2.4.1蛋白质浓度的测定

2.4.2酶活力及比活力的测定

2.4.3尼崎青霉菌的培养

2.4.4尼崎青霉菌GOD的制备

2.4.5尼崎青霉菌发酵液中GOD纯度的鉴定

2.4.6酶理化性质的测定

2.4.7酶催化反应的动力学性质研究

2.4.8酶的底物特异性研究

2.4.9酶活性中心必需基团的研究

2.4.10金属离子对酶活力的影响

2.4.11有机污染物对酶活力的影响

2.4.12变性剂对酶活力的影响

第三章实验结果

3.1尼崎青霉菌菌丝体葡萄糖氧化酶的提取

3.2尼崎青霉菌发酵液与菌丝体酶活力单位比较

3.2.1发酵培养不同时间对发酵液酶活力的影响

3.2.2发酵培养不同时间对菌丝体酶活力的影响

3.2.3发酵培养不同时间对发酵液和菌丝体总酶活力的影响

3.3尼崎青霉菌的培养条件的优化

3.3.1转速对发酵液酶活力的影响

3.3.2温度对发酵液酶活力的影响

3.3.3 Ca2+对发酵液酶活力的影响

3.3.4吐温80对发酵液酶活力的影响

3.4青霉葡萄糖氧化酶的分离纯化

3.5尼崎青霉GOD的纯度鉴定

3.6酶分子的理化性质

3.6.1酶分子的亚基数及亚基的的分子量测定

3.6.2酶分子的紫外特征吸收光谱测定

3.6.3酶的内源荧光特征

3.6.4酶的催化特异性研究

3.7该酶催化葡萄糖的动力学参数的测定

3.7.1酶催化反应的动力学性质研究

3.7.2酶催化葡萄糖反应的活化能测定

3.7.3酶催化反应最适pH及pH稳定性测定

3.7.4酶催化反应最适温度及温度稳定性的测定

3.8酶活性中心必需基团的研究

3.8.1 MT对酶的化学修饰

3.8.2组氨酸咪唑基的化学修饰

3.8.3 pCMB对酶的化学修饰

3.8.4酶活性中心色氨酸残基的化学修饰

3.8.5氨基的化学修饰

3.8.6精氨酸残基的化学修饰

3.8.7丝氨酸残基与酶活力的关系

3.8修饰剂对酶的效应动力学

3.8.1溴乙酸对酶活力影响及动力学研究

3.9.2 NBS对酶活力影响及动力学研究

3.9.3乙酰丙酮对酶活力影响及动力学研究

3.9几种离子对尼崎青霉菌GOD活力的影响

3.9.1卤素阴离子对尼崎青霉菌GOD活力的影响

3.10.2几种金属离子对青霉菌GOD活力的影响

3.10.3几种金属离子对尼崎青霉菌GOD的抑制作用类型

3.11几种有机溶剂对酶活力的影响及动力学研究

3.11.1醇对酶活力影响

3.11.2甲醛对青霉菌GOD活力的影响

3.12几种变性剂对酶活力的影响及动力学研究

3.12.1 EDTA对尼崎青霉菌GOD活力的影响

3.12.2脲对尼崎青霉菌GOD活力的影响

3.12.3盐酸胍对尼崎青霉菌GOD活力的影响

3.12.4 SDS对尼崎青霉菌GOD活力的影响

第四章讨论

4.1尼崎青霉菌培养条件的优化

4.2尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶(GOD)的粗酶液的制备

4.3尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶(GOD)的纯化

4.4尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶(GOD)酶学性质和动力学性质

4.5尼崎青霉菌GOD紫外特征光谱及内源荧光特征

4.6尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶(GOD)底物特异性

4.7尼崎青霉菌葡萄糖氧化酶(GOD)的化学修饰

4.8修饰剂对GOD的抑制动力学研究

4.9效应物对GOD活力的影响

结论

参考文献

已发表文章

致谢