Hsp90、Mcl-1蛋白复合体在靶向结肠癌抵抗Bcl-2治疗中的意义

摘要

目的：
　　本实验通过探讨Hsp90能否稳定Mcl-1及该作用在靶向结肠癌抵抗Bcl-2治疗中的意义。
　　方法：
　　1、利用免疫共沉淀技术分析人结肠癌细胞HCT116中Hsp90蛋白与Mcl-1蛋白的相互作用，明确二者是否存在在同一复合物中，为本研究的后续研究做好准备以及机制研究提供新的线索。
　　2、Bcl-2抑制剂ABT-737、Hsp90抑制剂17-AAG，以及两种抑制剂联合处理结肠癌细胞 HCT116，且 DMSO处理细胞作为对照组，用流式细胞仪检测结肠癌细胞HCT116细胞凋亡情况。
　　3、使用 Bcl-2特异性抑制剂 ABT-737处理结肠癌细胞 HCT-116，然后用Western blot检测细胞中Mcl-1蛋白表达水平，同样使用Bcl-2抑制剂ABT-737处理结肠癌细胞HCT-116，Western blot检测发现Hsp90的蛋白表达水平。
　　4、采用 RT-PCR检测用 Bcl-2特异性抑制剂处理结肠癌细胞后 Mcl-1的mRNA表达情况。
　　结果：
　　1、免疫共沉淀显示：Mcl-1的抗体可沉淀 Hsp90，而对照 IgG则没有沉淀物，用Hsp90的抗体也可以沉淀Mcl-1，以上说明在细胞内Mcl-1与Hsp90存在相互作用，即Hsp90和Mcl-1存在同一复合物中。
　　2、流式细胞术检测结果显示：Bcl-2抑制剂加Hsp90抑制剂处理组结肠癌细胞凋亡率为24.2%，Bcl-2抑制剂处理组结肠癌细胞凋亡率为（14.5%），溶剂对照组结肠癌细胞凋亡率为（0.7%）。且有统计学差异（P<0.05）。
　　3、使用Bcl-2特异性抑制剂ABT-737处理结肠癌细胞HCT-116，用Western blot检测细胞中Mcl-1蛋白表达水平，发现Mcl-1可呈时间依赖性表达增加；使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮抑制蛋白质合成后对照组细胞中Mcl-1在4小时内迅速降解，而ABT-737处理组细胞中Mcl-1稳定性增加，不被降解；同样，使用 Bcl-2抑制剂 ABT-737处理结肠癌细胞 HCT-116，Western blot检测发现ABT-737可诱导Hsp90的蛋白水平升高。
　　4、使用Bcl-2特异性抑制剂ABT-737处理结肠癌细胞HCT-116，RT-PCR检测发现，Mcl-1的mRNA表达水平并没有明显改变。
　　5、用siRNA同时沉默Hsp90α及Hsp90β后，Western blot检测发现：结肠癌细胞中，ABT-737对Mcl-1的上调作用消失，而Mcl-1蛋白表达水平下降。 结论：
　　1、 Mcl-1和Hsp90共同存在于结肠癌细胞HCT-116中；
　　2、 Bcl-2特异性抑制剂对Mcl-1的作用仅仅局限于蛋白质水平，而对其mRNA没有作用；
　　3、 Hsp90可能参与稳定抑凋亡蛋白Mcl-1,从而可能导致肿瘤细胞的永生化，这一作用在靶向Bcl-2结肠癌治疗抵抗中有重要意义。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

材料与方法

1 实验材料

1.1 细胞株

1.2 实验试剂

1.3 实验设备

2实验试剂配制

2.1 RPMI 1640完全细胞培养液：

2.2 Bcl-2抑制剂ABT-737母液的配制：

2.3 Hsp90抑制剂17-AAG母液的配制：

2.4 Western Blotting 主要试剂的配制：

3.1 细胞培养：

3.2流式细胞术检测细胞的凋亡率：

3.3免疫共沉淀：

3.4 Western Blot 检测相关蛋白表达：

3.5 定量PCR

4 统计学方法

实验结果

1．1 Bcl-2抑制剂、Hsp90抑制剂使结肠癌细胞凋亡率明显上升

1.2 Bcl-2抑制剂可在结肠癌细胞中诱导Mcl-1蛋白水平上调，但Mcl-1的mRNA水平无明显变化。

1.3免疫共沉淀实验证实Hsp90与Mcl-1存在于同一复合物中

1.4 Bcl-2抑制剂可诱导Hsp90水平升高，下调Hsp90后Bcl-2抑制剂对Mcl-1的上调作用消失，且Mcl-1发生降解。

讨论

结论

参考文献

综述：Bcl-2基因家族在恶性肿瘤中的研究进展及展望

致谢