球孢白僵菌N-乙酰氨基葡萄糖苷酶BbNag1的功能分析

摘要

昆虫病原真菌是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一，具有直接穿透昆虫体壁而使其致病的独特机制。在穿透昆虫体壁的过程中，真菌会分泌一系列的水解酶，如几丁质酶和蛋白酶，降解寄主体壁，帮助菌丝穿透。几丁质酶在降解昆虫体壁的过程中发挥重要的作用。几丁质经几丁质酶(内切、外切)降解成短链的几丁质产物，然后N—乙酰氨基葡萄糖苷酶再将其降解为N—乙酰氨基葡萄精胺单体。本实验室前期研究发现昆虫病原真菌球孢白僵菌几丁质酶Bbchitl是重要的毒力因子，那么球孢白僵菌中分解短链几丁质降解产物的酶N—乙酰氨基葡萄糖苷酶BbNagl(GenBank：ABG77528.1)是否也影响侵染速度呢? 本文以昆虫病原真菌球孢白僵菌中编码N—乙酰氨基葡萄糖苷酶BbNagl为研究对象，通过超量表达和同源重组技术，获得了BbNagl超量表达菌株和同源重组菌株，分析了该基因在侵染致病过程中的作用。主要研究结果如下： 1、序列分析表明，BbNagl含有一个1959 bp的开放阅读框，编码652个氨基酸，推测其分子量为71.9KDa，等电点为5.67。比较BbNagl基因组序列和cDNA序列发现，BbNagl不含内含子。结构分析发现属丁糖基水解酶家族20。同源性分析发现BbNagl与金龟子绿僵菌N—乙酰氨基葡萄糖苷酶同源性最高，达到69％。 2、几丁质酶活性检测表明，在0.2％胶体几丁质作为唯一碳源的条件下，与野生型菌株相比，BbNagl超量表达菌株在诱导24hr时几丁质酶活性提高，提高至少13％，而BbNagl同源重组菌株几丁质酶活性显著下降，最多下降7倍。因此BbNagl对球孢白僵菌的几丁质酶活性有显著的影响。 3、RT—PCR检测Bbchitl基因表达结果表明，在0.2％胶体几丁质作为唯一碳源的条件下，与野生型菌株和BbNagl超量表达菌株相比，BbNagl同源重组菌株的Bbchitl的表达受到明显下调。说明Bbchitl的表达受到BbNagl的影响。 4、生物测定表明，BbNagl与球孢白僵菌毒力相关。孢子浓度为1×107孢子/mL时，与野生型菌株相比，BbNagl超量表达菌株对桃蚜半致死时间(LT50)缩短6-9 hr；而BbNagl同源重组菌株对桃蚜半致死时间(LT50)延长了7-9 hr。LT50是评价昆虫病原真菌侵染速度的重要指标，由此说明BbNagl的表达对球孢白僵菌的侵染速度有一定影响。 上述结果表明，BbNagl能显并影响球孢白僵菌几丁质酶活性，且降低球孢白僵菌侵染速度，敲除BbNagl显著下凋几丁质酶Bbchitl的表达。

目录

文摘

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论文说明：附录：文中缩写

声明

第一章文献综述

1.1昆虫病原真菌侵染寄主致病的研究进展

1.1.1昆虫病原真菌的致病机制

1.1.2在致病过程中发挥作用的水解酶

1.1.3水解酶的协同作用

1.2真菌几丁质酶的研究进展

1.2.1真菌几丁质酶分布

1.2.2真菌几丁质酶的分类与结构

1.2.3真菌几丁质酶调控

1.2.4真菌几丁质酶的功能

第二章引言

2.1研究的背景和意义

2.2技术路线

第三章材料与方法

3.1材料

3.1.1菌株及主要载体

3.1.2主要试剂

3.1.3主要仪器设备

3.1.4主要培养基

3.1.5主要缓冲液配方

3.2方法

3.2.1蛋白质同源性与系统进化分析

3.2.2大肠杆菌感受态的制备与转化

3.2.3 BbNag1表达载体构建

3.2.4农杆菌感受态制备与转化

3.2.5农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化及转化子的筛选

3.2.6真菌DNA的提取

3.2.7真菌总RNA的提取

3.2.8几丁质酶活性测定方法

3.2.9球孢白僵菌转化子几丁质酶活性测定

3.2.10 GlcNAc标准曲线的制定

3.2.11生物测定

3.2.12 RT-PCR检测基因表达

第四章结果与分析

4.1 BbNag1序列分析

4.2 BbNag1超量表达和同源重组菌株的筛选与分子验证

4.2.1 BbNag1超量表达和同源重组载体的构建

4.2.2 BbNag1超量表达和同源重组菌株的筛选及分了验证

4.3 BbNag1对球孢白僵菌几丁质酶活性的影响

4.3.1 GlcNAc标准曲线的制备

4.3.2转化了几丁酶活性测定

4.4 BbNag1对球孢白僵菌Bbchit1的影响

4.5 BbNag1影响球孢白僵菌的侵染速度

第五章讨论

5.1 BbNag1对球孢白僵菌几丁质酶酶学特性的影响

5.2 BbNag1影响球孢白僵菌几丁质酶Bbchit1的表达

5.3 BbNag1对球孢白僵菌侵染速度的影响

第六章小结

参考文献

致谢