miR-183负调控下游靶基因PTPN4促进肺腺癌始动细胞侵袭迁移作用的研究

摘要

目的:
　　1.基于紫杉醇结合无血清培养获取CD133+/CD326+A549CSLCs并验证miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表达。
　　2.探讨miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的作用。
　　3.初步阐明miR-183调控CD133+/CD326+A549CSLCs侵袭转移的机制。
　　方法:
　　一.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表达
　　1.通过课题组前期逆向诱导联合药物筛选富集肺腺癌始动细胞的实验方法分离培养CD133+/CD326+A549CSLCs;应用流式荧光检测技术检测CD133+/CD326+ A549CSLCS比例;进行激光共聚焦方法直观观测CD133和CD326分子标记在富集细胞中的表达。
　　2.应用实时定量PCR技术检测普通A549细胞和CD133+/CD326+ A549CSLCs中miR-183的表达情况。
　　二.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的作用
　　1.通过构建miR-183慢病毒过表达和干扰载体，首先根据基因序列设计并合成互补oligo DNA，经过退火、连接将目的片段连接至pcDNA6.2-GW/EmGFP质粒上，经过转化后挑取3个克隆，摇菌抽提质粒后进行测序，验证pcDNA6.2-GW/EmGFP-mi-183重组克隆中插入片段序列与设计的寡聚单链DNA序列一致;使用Invitrogen公司的BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上，从平板挑取阳性克隆并测序验证，所得结果符合设计要求;最后用构建的慢病毒表达载体和重组质粒共转染293T细胞，包装病毒，组装成pLenti6.3-anti-miR-183，收集病毒原液，超速离心浓缩，并通过测定方法获得病毒滴度。经过测序结果显示，我们成功构建了pLenti6.3-miR-183和pLenti6.3-anti-miR-183慢病毒载体，并得到了较为准确的病毒滴度值，为后续实验研究奠定了基础。
　　2.通过转染实验构建miR-183过表达和干扰的CD133+/CD326+A549CSLCs，实时定量PCR检测miR-183在转染慢病毒载体的CD133+/CD326+A549CSLCs中的表达。
　　3.裸鼠体内成瘤实验，并通过生物荧光技术检测裸鼠肺部形成转移瘤荧光强度;CCK8检测miR-183过表达组CD133+/CD326+A549CSLCs增殖效应;体外Transwell实验检测miR-183过表达或低表达的CD133+/CD326+A549CSLCs的迁移和侵袭现象。
　　三.miR-183调控CD133+/CD326+A549CSLCs侵袭迁移的作用机制
　　1.基于生物信息学预测分析平台，预测miR-183下游靶点;双荧光素酶基因报告载体系统间接验证miR-183下游靶基因PTPN4; qRT-PCR和westernblot直接验证经慢病毒转染低表达miR-183的CD133+/CD326+A549CSLCs中PTPN4基因和蛋白表达水平。
　　2.构建了PTPN4过表达质粒，并设计miR-183过表达和PTPN4过表达共转染CD133+/CD326+A549CSLCs实验，应用westernblot检测了四组中PTPN4的蛋白表达水平;重复Transwell侵袭实验检测了四组中侵袭的细胞数。
　　3.结合临床肺腺癌标本，应用qRT-PCR检测组织标本中PTPN4基因的表达水平。
　　结果:
　　1.miR-183在CD133+/CD326+A549CSLCs中的表达显著升高
　　采用临床用紫杉醇针剂(30mg/5 ml)，加药浓度选定0.1μmol/L，加药时间为48h;利用活细胞与细胞碎片的质量差异采用rpm800转进行离心，所得细胞克隆继续无血清悬浮培养，经过两周时间，细胞的活性能够恢复如初，在体外可以连续传代培养，细胞大量成球生长，细胞膜圆润完整，胞浆折光性好，隔天即可以传代。流式荧光检测技术可见富集的CD133+/CD326+ A549 CSLCs比例在68％左右。
　　实时定量PCR技术检测普通A549细胞和CD133+/CD326+ A549 CSLCs中miR-183的表达，发现CD133+/CD326+ A549 CSLCs中miR-183表达较普通A549细胞显著升高。
　　2.miR-183促进CD133+/CD326+ A549 CSLCs侵袭和迁移。
　　为进一步研究miR-183在CD133+/CD326+ A549 CSLCS中的作用，我们成功构建了miR-183慢病毒过表达和干扰载体pLenti6.3-miR-183和pLenti6.3-anti-miR-183，我们将其转染CD133+/CD326+ A549 CSLCS，建立miR-183过表达和干扰的CD133+/CD326+ A549CSLCS，免疫荧光结果提示携带有GFP的慢病毒质粒成功转染进CD133+/CD326+ A549CSLCS;经实时定量PCR检测miR-183在转染慢病毒载体的CD133+/CD326+ A549 CSLCS中的表达，pLenti6.3-miR-183转染组中miR-183较对照组显著升高，而在pLenti6.3-anti-miR-183转染组中miR-183较对照组显著降低，这一结果进一步证明我们转染成功。由此我们获得了稳定表达miR-183和anti-183的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，这些细胞为我们随后体内、体外实验研究miR-183在肺腺癌始动细胞中的作用提供了细胞支撑。
　　结合课题组前期实验数据，我们进行了裸鼠体内成瘤实验，经裸鼠尾静脉注射pLenti6.3-miR-183转染的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，28天后经生物荧光技术检测发现裸鼠肺部形成转移瘤，且miR-183过表达组所形成的转移瘤的荧光强度较对照组明显增强;同时为排除CD133+/CD326+ A549 CSLCS增殖所带来的影响，我们用CCK8对miR-183过表达组和对照组进行了检测，结果显示两组无明显差异;我们还进行了体外Transwell实验检测了miR-183过表达或低表达的CD133/CD326双阳性细胞的迁移和侵袭现象，发现miR-183过表达组较对照组产生迁移和侵袭的细胞数明显增多，而miR-183低表达组则较对照组迁移及侵袭的细胞数明显减少。体内外结果均提示miR-183在CD133+/CD326+ A549 CSLCS中发挥促侵袭和迁移的作用，表明miR-183可作为致癌基因促进肿瘤的侵袭转移。
　　3.miR-183通过负调控PTPN4促进CD133+/CD326+ A549 CSLCS侵袭作用
　　我们利用targetscan、picTar、miRanda等网络miRNA靶基因预测系统，发现miR-183潜在的下游靶点包括有癌基因、抑癌基因、细胞信号转导分子，细胞周期调控基因和与侵袭转移相关的分子，例如EGR1，PTPN4，ZEB1，PTEN和PDCD4等。
　　我们利用双荧光素酶基因报告载体系统将PTPN4野生型和突变型的3'-UTR区重组到pGL3质粒载体上，然后和miR-183共转染293T细胞，通过荧光活性检测，野生型组荧光强度显著降低，而突变组无明显变化。随后我们又通过在基因水平和蛋白水平直接检测经慢病毒转染低表达miR-183的CD133+/CD326+ A549 CSLCS，PTPN4基因和蛋白表达水平较对照组明显上升。间接实验和直接实验均验证了PTPN4是miR-183下游靶点之一。
　　我们构建了PTPN4过表达载体，并设计了共转染实验，首先，我们应用western blot检测了四组中PTPN4的蛋白表达水平，可见miR-control+PTPN4过表达组PTPN4较其他三组显著上升，miR-183过表达+vector组较其他组明显下降;其次我们利用上述四组细胞重复了Transwell侵袭实验，细胞计数结果显示miR-183过表达+vector组侵袭细胞数最多，与miR-control+vector组和miR-183过表达+PTPN4过表达组存在明显差异，而miR-control+PTPN4过表达组发生侵袭的细胞数最少，较miR-control+vector组有显著差异;最后我们对临床肺腺癌标本检测了miR-183和PTPN4基因的表达水平，发现无转移标本的PTPN4基因表达较有转移标本显著降低;相关分析表明，在同一肺腺癌组织标本中miR-183表达水平与PTPN4mRNA表达水平呈显著负相关。上述实验结果提示，miR-183可以通过直接负调控下游靶基因PTPN4发挥促进CD133+/CD326+A549 CSLCS侵袭迁移的作用。
　　结论:
　　miR-183可以通过绑定PTPN4的3'UTR区使其降解和抑制翻译，从而达到抑制PTPN4的表达。CD133+/CD326+ A549 CSLCs中miR-183高表达可以通过抑制PTPN4表达而促进CD133+/CD326+ A549 CSLCs侵袭和迁移。

目录

声明

英文缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 肺腺癌始动细胞的分离、培养及miR-183的检测

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 miR-183促进肺腺癌始动细胞迁移和侵袭

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 miR-183促进肺腺癌始动细胞迁移和侵袭的机制

4．1 引言

4．2 材料和方法

4．3 结果

4．4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述一 miR-183家族对肿瘤发生调控的研究进展

文献综述二 MicroRNA在肺癌诊断和治疗中的研究进展

攻读博士期间发表的论文

致谢