特异性siRNA抑制人肺癌细胞95D中hTERT基因表达及细胞生长的实验研究

摘要

研究背景与目的： 肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，在所有癌症的发病率和死亡率中，肺癌始终位于前列。在我国肺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病率的首位和第二位，而男女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌。肺癌对人类的健康已经构成了严重的威胁。因此人们在重视手术治疗、放疗、化疗等传统治疗手段的同时，也在积极探寻新的疗法。 肿瘤基因治疗近年来作为癌症治疗研究的新热点得到不断发展。其中RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种从低等植物到高等哺乳动物普遍存在的生物学现象，是由小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）引导的靶mRNA降解的转录后基因沉默。通过RNA干扰对关键基因的沉默作用，可以抑制致病核酸的表达或者异常蛋白的合成。与其他基因治疗手段相比，RNA干扰技术显示出高效性、特异性、便捷性等优越之处，正在引领基因治疗的新潮流，具有可观的应用前景。 基因治疗需要有效的靶位点，因此筛选有效的基因治疗靶点十分重要。已知端粒酶活性几乎在绝大多数人类恶性肿瘤中都可以检测到，而在几乎所有的成人体细胞中呈现阴性，因此与恶性肿瘤之间有很高的相关性。端粒酶的高活性在肺癌的发生、发展中有亦有着重要作用，其催化亚基端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）是端粒酶活性和肿瘤发展中的决定性因子，因而有望成为肺癌基因治疗的理想靶点。 本研究利用实时荧光定量PCR技术对肺癌细胞中的hTERT mRNA表达进行定量分析，筛选出相对表达量最高的肺癌细胞株95D。将化学合成的siRNA转染入95D细胞中，探讨针对hTERT的特异性siRNA介导的RNA干扰对肺癌细胞中hTERT基因表达的沉默及对肺癌细胞增殖的抑制作用。 研究内容和方法： 1．优化PCR条件，通过Real Time RT-PCR技术检测人肺癌细胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERT mRNA的相对表达量。 2．根据hTERT基因序列和siRNA设计原则，设计并化学合成三对siRNA，将siRNA转染入hTERT mRNA高表达的肺巨细胞癌细胞95D中，应用Real Time RT-PCR技术检测转染后hTERT mRNA表达水平变化情况。 3．流式细胞术检测hTERT siRNA转染后所介导的RNA干扰作用对于肺癌细胞凋亡水平的诱导和影响。 4．MTT法检测hTERT siRNA对于肺癌细胞生长、增殖能力的抑制作用。 结果： 1．目的基因和内参照基因的PCR产物片段大小均与预计值一致，说明各细胞中RNA提取及RT-PCR过程均良好。Real Time RT-PCR结果表明hTERT mRNA在多个肺癌细胞系中均高表达，其中在肺巨细胞癌95D中相对表达量最高。以95D为实验对象进行RNA干扰研究。 2．hTERT siRNA转染95D细胞48小时后（转染浓度为100nmol/L），与空白脂质体对照组和阴性对照组比较，siRNA-1和siRNA-2均明显抑制了hTERTmRNA表达（P值均小于0．01），抑制率分别为77．33±5．13%和50．67±8．02%，siRNA-3抑制率较低，仅为27．67±10．26%。 3．选取抑制效果最显著的hTERT siRNA-1对95D肺癌细胞进行由低到高3个浓度的转染，转染浓度分别为50nmol/L，80nmol/L，100nmol/L。50nmol/L浓度转染组与阴性对照组之间hTERT mRNA表达量差异无统计学意义（P>0．05）。80nmol/L组、100nmol/L浓度转染组分别与阴性对照组比较，hTERT mRNA表达量差异均有统计学意义（P值均小于0．01），而这两组之间差异无统计学意义（P>0．05）。 4．转染48h后，与空白脂质体对照组比较，50nmol/L、80mol/L、100nmol/L浓度的hTERT siRNA-1转染组细胞凋亡率均显著增加（P值均小于0．01）。与阴性对照组比较，50nmol/L浓度转染组的细胞凋亡率无显著增加（P>0．05），而80nmol/L、100nmol/L组细胞凋亡率显著增加（P值均小于0．01）。空白脂质体对照组与阴性对照组比较亦有显著差异（P<0．05）。 5．MTT检测结果显示，转染12小时后肺癌细胞增殖抑制作用开始显现，但效果尚弱，24小时已较明显，48小时最显著，72小时抑制效果转弱。hTERTsiRNA可以有效抑制肺癌细胞增殖，抑制效应具有时间依赖性。 结论： 1．人肺癌细胞系L78、NCI-H520、A549、LTEP-α-2、NCI-H460和95D中hTERT mRNA均高表达，其中肺巨细胞癌细胞95D相对表达量最高。为下一步进行的RNA干扰实验研究的细胞模型的选择奠定了基础。 2．有效设计并合成了特异性针对hTERT的siRNA，可以有效下调肺巨细胞癌细胞95D的端粒酶hTERT mRNA表达，从而抑制端粒酶活性、诱导肺癌细胞凋亡，抑制肺癌细胞增殖。

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文摘

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材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

综述：端粒酶、端粒酶逆转录酶与肺癌诊疗的研究进展

致谢