毕赤酵母GS115中新型NADPH依赖羰基还原酶的基因克隆及酶学性质研究

摘要

光学纯的醇类化合物是合成一些高附加值化学品的基石。直接得到光学纯醇类的方法是还原前手性的酮类，主要有化学法和生物法两种，其中生物法作为化学法的补充已经用于一些手性醇的生产。羰基还原酶能够催化一些羰基底物生成R-或者S-手性醇，但在实际应用中许多药物前体的分子比较大，用化学法比较难还原或者产物ee值不高，所以利用羰基还原酶催化一些立体结构较大的羰基底物的不对称还原已成为研究热点。
　　巴斯德毕赤酵母GS115主要用于重组蛋白的表达，它的基因组已经被测序，基因所表达蛋白的功能也被预测，所以这方便了从其基因组中挖掘新的羰基还原酶。本课题通过对毕赤酵母GS115基因组序列分析同时与已知的羰基还原酶的蛋白序列比对，在3号染色体上发现了一个可能的羰基还原酶基因pascr(GeneBankAccessionNO.XM_002492630.1)。这个基因被克隆并且在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中进行了表达，重组蛋白通过Ni-NTA纯化后，对其性质进行研究。
　　氨基酸序列比对结果表明羰基还原酶PasCR属于短链脱氢酶家族，该酶专一性地利用NADPH作为辅酶，最适反应pH为磷酸缓冲液pH6.5，最适反应温度为35℃，在45℃时的半衰期约为80min，而在50℃时半衰期只有10min，同时分子筛结果表明酶在溶液中以二聚体形式存在。羰基还原酶PasCR表现出较广的底物谱和立体选择性，其选择性遵循Prelog的规则。它能够不对称催化一系列的前手性酮包括脂肪酮、芳香酮、酮酯等生成相应的醇，许多产物ee值＞99％，同时有较高的转化率。对底物谱的进一步研究发现PasCR能够还原一些体积较大的二芳香酮类物质，比如4-甲基二苯甲酮、4-氯二苯甲酮、2-氯二苯甲酮等，对4-甲基二苯甲酮的还原产物的ee值达到了85％。羰基还原酶PasCR对芳香醛类物质也有较高活性，它能够催化苯甲酰甲醛还原生成(R）-1-苯基-1，2-乙二醇，在30mM底物浓度50mL的反应体系中转化率和ee值都达到了99％。
　　综上所述，来源于毕赤酵母GS115的羰基还原酶PasCR表现出了较广的底物谱、较高的立体选择性，能催化一些体积较大的芳香酮的高立体选择性还原，能够同时还原苯甲酰甲醛中的醛基和酮基生成光学纯的(R）-1-苯基-1，2-乙二醇。结果表明该酶具有一定的特性和较好的应用价值。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 生物催化概述

1．1．1 生物催化定义

1．1．2 生物催化的优点

1．1．3 生物催化方式

1．1．4 工业规模的生物催化

1．2 羰基还原酶概述

1．2．1 羰基还原酶分类

1．2．2 羰基还原酶研究进展及应用

1．3 生物信息学在发现新的羰基还原酶中的应用

1．4 本课题研究目的、意义及内容

1．4．1 本课题研究的目的和意义

1．4．2 本课题研究的内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种与质粒

2．1．2 实验主要仪器及耗材

2．1．3 实验主要试剂

2．1．4 实验所选用底物

2．1．5 实验主要用到的缓冲液

2．2 实验方法

2．2．1 基因组的提取

2．2．2 目的基因的分析及克隆

2．2．3 目的基因的表达与优化

2．2．4 蛋白的大量表达及纯化

2．2．5 酶学性质测定

2．2．6 羰基还原酶PasCR底物谱的研究

2．2．7 羰基还原酶不对称还原苯甲酰甲醛生成(R)-1-苯基-1，2-乙二醇

2．2．8 检测方法

3 结果与讨论

3．1 羰基还原酶基因的筛选

3．2 羰基还原酶的克隆表达、纯化及性质初步测定

3．2．1 羰基还原酶基因的扩增

3．2．2 表达质粒的构建及验证

3．2．3 蛋白的表达及小量纯化

3．2．4 以4-氯-3-羰基丁酸乙酯为底物对酶进行筛选

3．2．5 以苯乙酮为底物对酶进行复筛

3．3 羰基还原酶chr3_0449(PasCR)的序列比对及分析

3．4 羰基还原酶PasCR的表达优化及酶学性质研究

3．4．1 羰基还原酶PaSCR的表达优化

3．4．2 PasCR的纯化

3．4．3 酶学性质测定

3．4．4 羰基还原酶PasCR对二芳香基甲酮的不对称还原

3．4．5 羰基还原酶PasCR对其他羰基底物的性质

3．4．6 PasCR还原苯甲酰甲醛生成光学纯(R)-1-苯基-1，2-乙二醇

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士期间发表论文情况

致谢