九种黄酮类化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞PGE2、COX-2表达的影响

摘要

炎症是机体对有害刺激所产生的一种应急反应，而慢性炎症会产生细胞和组织的损伤，进而导致各种疾病。以炎症因子为靶点的抗炎天然药物的开发被认为控制慢性炎症的有效途径。环氧合酶2(COX-2)和前列腺素E2(PGE2)是目前抗炎药物筛选的两个重要靶点。COX-2在炎症位点大量表达，并催化生成PGE2，而PGE2影响细胞增殖和肿瘤的生长，并引起疼痛症状。
　　本课题选择九种天然黄酮类化合物为研究对象，通过建立小鼠RAW264.7巨噬细胞的炎症模型，利用细胞流式技术以及酶联免疫检测等实验手段，以COX-2和PGE2为检测指标，在体外细胞水平上初步探究了该九种化合物抗炎效果。该九种黄酮天然产物包括:木犀草素、芹菜素、黄岑配基、染料木素、芦丁、槲皮素、金丝桃甙、异槲皮苷、杨梅素。
　　本文首先通过脂多糖刺激正常的小鼠RAW264.7巨噬细胞，为抗炎药物的筛选建立了体外细胞炎症模型。将该炎症模型细胞在含有一定浓度(10μmol/L和50μmol/L)的黄酮的培养基中进行孵育，利用MTT法检测九种黄酮对于细胞增殖的影响，结果显示与对照组相比，异槲皮苷和杨梅素在不同浓度下对小鼠巨噬细胞RAW264.7的细胞增殖并无显著影响。其次通过细胞流式技术检测炎症细胞在不同黄酮的孵育下的COX-2的表达量，并利用酶联免疫分析法(ELISA)检测PGE2的合成量，实验结果表明九种黄酮类化合物对COX-2的表达和PGE2的合成均有抑制作用，而异槲皮苷的抑制作用最强。本文进而利用不同浓度(1，5，15，25，50和100μmol/L)的异槲皮苷孵育炎症细胞，发现异槲皮苷对于COX-2和PGE2的抑制作用为浓度依赖型，进一步分析得到异槲皮苷对COX-2和PGE2表达的抑制作用的半数抑制浓度IC50值分别为65μmol/L和25μmol/L。综上，本文检测了九种黄酮化合物的抗炎活性，其活性表现在对炎症细胞的COX-2的表达和PGE2的合成有抑制作用，并通过筛选发现，在九种黄酮化合物中异槲皮苷表现出最强的抗炎活性，进而对其浓度与抗炎活性的关系进行了探讨。本文推测异槲皮苷的抗炎机制为通过抑制COX-2的表达，从而抑制其下游炎症因子PGE2的合成。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 黄酮类化合物

1．1．1 黄酮类化合物的定义

1．1．2 黄酮类化合物的性质

1．1．3 黄酮类化合物的生物活性

1．2 黄酮类成分抗炎作用机制

1．2．1 炎症

1．2．2 炎症介质

1．2．3 炎症机制及主要代谢途径

1．3 环氧合酶-2及其抑制剂的研究

1．3．1 环氧合酶的概述

1．3．2 COX-2及其产物的作用和影响

1．3．3 环氧合酶-2与相关疾病的关系

1．3．4 环氧合酶抑制剂

1．4 抗炎药物的筛选

1．4．1 抗炎模型的建立

1．4．2 论文采用的炎症细胞模型

1．5 流式细胞技术研究背景

1．5．1 流式细胞术概述

1．5．2 抗炎药物筛选中流式细胞仪的运用

1．6 本论文研究的目的、意义以及内容

1．6．1 本论文研究的目的和意义

1．6．2 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要材料

2．1．2 主要仪器和设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 耗材

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞炎症模型的建立

2．2．3 黄酮化合物对细胞毒性的影响

2．2．4 黄酮类化合物对PGE2的抑制作用

2．2．5 黄酮类化合物对COX-2表达的影响

2．2．6 用7-AAD抗体检测细胞活性的影响

2．2．7 流式细胞仪LSRII使用

2．2．8 统计学处理

3 结果与讨论

3．1 黄酮类化合物的筛选

3．2 LPS诱导的RAW264．7细胞炎症模型的建立

3．2．1 小鼠单核巨噬细胞RAW264．7的培养

3．2．2 体外RAW264．7细胞炎症模型的建立

3．3 九种黄酮类化合物对细胞毒性的影响

3．3．1 九种黄酮类化合物对细胞形态的影响

3．3．2 MTT法检测九种黄酮类天然产物对细胞活力的影响

3．4 不同浓度LPS对细胞形态及COX-2表达的影响

3．5 九种黄酮类化合物对PGE2的抑制作用

3．5．1 标准曲线

3．5．2 九种黄酮类化合物对PGE2的抑制作用

3．6 九种黄酮类化合物对COX-2表达下调能力的影响

3．7 异槲皮苷对细胞活性的影响

3．8 异槲皮苷对PGE2产物及COX-2表达的影响

3．8．1 异槲皮苷对PGE2产物的抑制作用

3．8．2 异槲皮苷下调COX-2表达的影响

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士研究生学位期间发表论文情况

致谢