SPA-EGFP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其在免疫诊断中的应用

摘要

免疫荧光测定法(immunofluorescence assay，IFA)在医学和生物学研究中的应用已有近60年的历史，其原理就是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，以荧光物质标记抗体，对组织或细胞内的抗原物质进行定位检测。然而，传统荧光染料在荧光显微镜激发光照射下易发生光漂白现象，而且传统抗体制备及标记方法易降低抗体效价并产生非特异性染色。因此开发新的荧光标记物及标记方法是很有意义的。近年来，关于绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)融合单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)检测相应抗原的报道很多，但每检测一种抗原就要制备相应的融合抗体且敏感性较差。葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SPA)具有和人等多种动物IgG结合的能力，被称为“广泛二抗”，可为多种标记物所标记，已广泛用于各种免疫测定技术的间接法。用SPA代替scFv与GFP融合表达将有望得到一种新型免疫荧光检测试剂以弥补以上不足。 基于以上设想，本实验室构建了spa与egfp融合基因的原核分泌表达载体pEZZl8/egfp，并在大肠杆菌(Ecoli DH5α)中成功表达，得到的融合蛋白既有荧光活性又有IgG结合活性，但原核分泌表达存在分泌效率低、胞内表达产物分离纯化步骤繁琐且信号肽不能有效切除等问题。本研究在前期工作基础上将spa-egfp融合基因转入毕赤酵母(Pichiapastor GSll5)进行分泌表达，克服了上述缺点，并初步研究了表达产物SPA-EGFP作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫诊断方面的应用表现。 本研究通过PCR技术从质粒pEZZl8/egfp)中扩增出spa-egfp融合基因，再将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中，成功构建了重组质粒pPIC9K/spa-egfp，并测序鉴定。重组质粒经SalI线性化后，电转化毕赤酵母GSll5，经组氨酸营养缺陷型培养基(MD平板)和YPD-G418平板筛选得到高拷贝酵母转化子，PCR鉴定，甲醇诱导表达。培养上清经SDS-PAGE分析显示，诱导表达蛋白的表观分子量约为43kD，与预期的融合蛋白分子量相近，初步验证了融合蛋白的分泌表达。通过比较不同G418抗性工程菌的表达量，确定最佳表达菌株为1.5mg/L G418抗性的工程菌，诱导84h时表达量最高。通过正交设计对影响毕赤酵母表达量的几个因素水平进行优化，确定添加磷酸钾缓冲液使培养基pH值保持7.0，同时添加1％的Casamino acids，目的蛋白的表达量提高了341.4％，达到107mg/L，占培养上清总蛋白的70％以上。培养上清经镍柱亲和层析一步纯化后得到的蛋白在SDS-PAGE上显示为约43kD的单一条带，纯度达95％以上。该蛋白的荧光激发光谱和荧光发射光谱经测定与EGFP基本一致；竞争ELISA实验还显示该蛋白具有IgG结合活性，以上均说明融合蛋白SPA-EGFP在毕赤酵母中的分泌表达获得成功，与原核表达比较，表达量得到大幅度提高，信号肽能有效切除，分离纯化步骤简单易行。 免疫荧光测定法在临床上已用作病原体的检验及自身免疫性疾病的诊断等。本研究以纯化的融合蛋白SPA-EGFP替代FITC标记的羊抗人IgG抗体，用于抗细胞核抗体(ANA)的间接免疫荧光检测、天疱疮抗体的直接免疫荧光检测、抗肺炎支原体IgG抗体的间接免疫荧光检测均获得良好的结果，初步验证了其作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫荧光测定中应用的可行性及优势。 本研究取得的主要成果有： (1)成功构建了分泌性表达SPA-EGFP融合蛋白的毕赤酵母工程菌株，克服了原核表达的弊端； (2)对SPA-EGFP在毕赤酵母中分泌表达的条件进行了优化，提高了表达量； (3)首次将SPA-EGFP融合蛋白用于病原体检测及自身免疫性疾病的诊断，取得良好结果，为其作为一种新型免疫荧光检测试剂的应用推广提供了实验依据。

目录

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摘要

符号说明

第一章前言

第二章spa-egfp融合基因毕赤酵母工程菌的构建及筛选

第三章SPA-EGFP融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及活性检测

第四章SPA-EGFP融合蛋白在免疫诊断中的应用

第五章结论与展望

附录

参考文献

致谢

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