伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病的分子遗传学研究

摘要

研究背景和目的：慢性粒细胞白血病(chronic myeloidleLl kaemia，CML)是血液系统常见肿瘤增生性疾病之一，疾病侵犯血液系统中粒/巨噬系细胞，临床表现为粒细胞显著增多。流行病学资料显示，CML中位发病年龄为45～55岁，其中一半的患者年龄超过60岁。 CML的分子遗传学特征是费城染色体(Philadelphiachromosome，Ph)的出现。Ph染色体是由9q34上的Abelson小鼠白血病病毒癌基因(Abelson murine leukaemia Viral oncogene，ABL)与22qll上的断裂点聚集区(breakpoint cluster region，BCR)基因发生易位融合而成。该融合基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有异常活化的酪氨酸激酶活性，能够持续磷酸化各种底物，促进细胞增生，抑制细胞凋亡，破坏细胞之间连接，产生CML慢性期各种病理过程。继发的其他基因异常可以引起CML疾病由慢性期进展到加速期或急性期。 目前，CML治疗方法包括常规化学治疗、干扰素a(Interferon-a，IFN-a)治疗、异基因骨髓移植(allogenetic bone marrowtransplantation，allo-BMT)和造血干细胞移植(hematopoietic stemcell transplantation，HSCT)等。化疗虽然可以使大多数CML趋于稳定，但是多年来CML中位数存活期并未明显改善。异基因骨髓移植是有效根治CML的手段，但是成功率与年龄有关，老年人身体基础较差，成功率较低，因此对老年人患者并不适用。 甲磺酸伊马替尼 (imatinib mesylate，简称伊马替尼，STl571，格列卫 ，Gleevec /Glivec )是一种特异性ABL激酶抑制剂。它可以竞争性阻断ABL激酶上三磷酸腺苷(ATP)结合位点从而阻断白血病的发病途径，使CML的治疗取得突破性进展。Ⅰ期至Ⅲ期国际临床试验已证实伊马替尼可以使41％IFN-a治疗无效的Ph阳性(Ph+)慢性期CML患者和76％初治Ph+CML慢性期患者获得完全遗传学缓解，同时，对加速期和急性期患者也有很好疗效。 但是，目前伊马替尼治疗CML仍存在两大障碍。第一，伊马替尼并不能逆转致病基因BCR-ABL，即使患者达到完全细胞遗传学缓解，体内仍有残留的白血病细胞，称为微小残留病(MRD)。近期研究认为，这部分细胞多为处于静止期的肿瘤干细胞，具有无限自我更新能力，对伊马替尼不敏感，一定条件下可以重新进入细胞周期而造成患者复发。第二，部分患者，尤其是加速期和急性期患者，最初对伊马替尼反应良好，但是随着治疗的进展会出现伊马替尼耐药，表现为患者复发或病程进展。 针对伊马替尼治疗中的两大问题，本研究从分子生物学和细胞遗传学角度，研究伊马替尼治疗中肿瘤细胞残余及耐药发生的机制，建立临床监测MRD和预测伊马替尼疗效的方法，探讨其临床意义。 研究方法：应用Taq man技术原理，建立实时定量RT-PCR方法，检测CML患者骨髓和外周血BCR-ABL mRNA转录水平。应用该方法对17例伊马替尼治疗的Ph+慢性期CML患者，从治疗开始，每3个月随访检测骨髓和外周血BCR-ABL转录水平。中位随访时间30个月(9～33个月)，共检测113对骨髓和外周血匹配样本。结合患者临床症状、外周血检查、骨髓形态学检查、细胞遗传学检查评价伊马替尼疗效。建立实时定量RT-PCR检测外周血凋亡相关基因B CL-2、BCL-X<,L>、BAX、BAD和BCL-Xs mRNA的表达水平。针对伊马替尼治疗过程中肿瘤细胞残留的问题，选取29例新诊Ph+慢性期CML患者，给予伊马替尼400mg/天治疗，随访BCR-ABL转录水平至少l2个月。按照分子缓解标准，BCR—ABL转录水平较治疗前下降至少3log(以10为底指数级)，将患者分为分子缓解组和分子未缓解组。比较患者治疗前凋亡相关基因表达水平的差异，并建立logistic回归模型，判断患者治疗前临床和实验室检查指标以及凋亡相关基因的表达与患者分子缓解与否的关系。针对伊马替尼耐药问题，通过半巢式PCR扩增ABL激酶结构域，并对该区域进行测序，寻找点突变；亚克隆患者BCR-ABL片断，对单个克隆进行测序，以提高检测点突变的敏感性，发现存在比例较少的点突变以及ABL激酶结构域其他基因改变。应用上述方法对4l例伊马替尼治疗的患者进行追踪检测，研究ABL激酶结构域点突变发生几率和发生时间，寻找ABL激酶结构域其他基因改变。结合患者临床表现和细胞遗传学改变，探讨ABL激酶结构域分子遗传学改变与临床伊马替尼耐药的关系，探索伊马替尼耐药的可能机制。 结果：实时定量RT-PCR检测患者骨髓和外周血BCR-ABL转录水平结果有良好的相关性，同时，与传统细胞遗传学检查也有良好的相关性。伊马替尼治疗前，不同患者BCR-ABL转录水平相差较大，在1log即lO倍左右。获得完全细胞遗传学缓解的患者，BCR-ABL转录水平可以相差31og即l 000倍以上。伊马替尼可以使几乎所有患者外周血象和骨髓象恢复正常，70％患者达到完全细胞遗传学缓解。伊马替尼治疗前6个月患者BCR-ABL转录水平迅速下降，6～12个月BCR-ABL转录水平下降减缓。治疗12～15个月之后，患者BCR-ABL转录水平进入平台期，并可以长时间维持在该水平。 对CML患者检测凋亡相关基因转录水平显示，CML患者BCL-2和BAD转录水平较正常人显著降低，而分子缓解患者BAD转录水平显著低于分子未缓解患者。Logistic回归模型显示BAD基因转录水平与CML患者经伊马替尼治疗能否达到分子缓解显著相关。通过对半巢式PCR扩增的ABL激酶结构域进行测序，共检出8例患者存在该结构域点突变。按照患者的病程区分，6.6％的早慢性期患者、43％晚慢性期患者和100％加速期患者被检出点突变，晚慢性期和加速期患者突变检出率显著高于早慢性期患者。ABL结构域点突变多于患者复发后被检出，伊马替尼治疗前检测不到点突变，患者复发前极少可以检测到点突变。具有同样点突变的患者，对伊马替尼治疗的反应并不相同。部分患者即使复发后，点突变也不能被持续检出。对部分患者BCR-ABL片断亚克隆进行测序分析，发现患者体内存在比例很少的点突变克隆，同时检测出基因片断的插入和缺失。 结论：利用实时定量RT-PCR检测CML患者BCR-ABL转录水平，可以敏感、准确的监测MRD。伊马替尼清除CML肿瘤细胞呈现双相性，最初6个月清除速度快，BCR-ABL转录水平迅速降低，然后清除速度减缓，12～15个月BCR-ABL转录水平进入平台期。伊马替尼并不能清除所有肿瘤细胞，患者体内有部分肿瘤干细胞残留，成为CML复发根源；但伊马替尼可以有效的将这部分细胞长时间控制在静止期。CML患者体内细胞凋亡途径失调，但是很难根据一、两种基因的改变推测其对细胞凋亡最终结局的影响。凋亡相关基因的改变与CML患者伊马替尼治疗的分子反应相关。CML患者ABL激酶结构域点突变和伊马替尼耐药显示出一定相关性。具有相同点突变的CML患者对伊马替尼的反应的不一致，以及部分患者具有点突变但未表现出临床耐药症状，表明ABL激酶结构域点突变本身并不足以引起伊马替尼耐药。部分耐药患者点突变不能被持续检出，即使复发后样本也可以呈现野生型表现，表明突变克隆存在但不一定扩增。亚克隆测序结果显示部分耐药患者除了具有ABL激酶结构域点突变外，还具有基因片断的插入和缺失。这部分患者ABL激酶结构域点突变的比例都比较小，因此，这些基因改变有可能是这部分患者发生伊马替尼耐药的原因。 意义：伊马替尼的问世对CML的治疗具有划时代的意义，其疗效卓越，在国际上成为治疗CML的-线药物。与其他化疗药物不同，伊马替尼副反应小，大多数患者均可耐受，对不宜进行骨髓移植的老年患者提供了新的有效的治疗。目前，如何解决伊马替尼治疗中的肿瘤细胞残余和耐药问题是世界性的课题。通过实时定量RT-PCR检测患者BCR-ABL转录水平，可以有效的监测MRD。该方法逐渐在临床推广应用，对治疗具有指导作用。应用该方法所提出的“分子缓解”反映了患者体内肿瘤细胞残余水平。实验证实了CML患者凋亡途径受到影响，因此筛选凋亡相关基因预测患者能否达到分子缓解具有可行性。对凋亡相关基因检测的实验结果经进一步证实后，可以作为预测患者体内肿瘤细胞残余水平的分子标志。ABL激酶结构域点突变与伊马替尼耐药相关，尤其是加速期患者，点突变的检出具有十分重要的临床意义。对慢性期患者，伊马替尼耐药并不能被点突变所解释，因此对检测结果应慎重考虑。随着第二代酪氨酸激酶阻滞剂相继出现，治疗CML的选择越来越多，如dasatinib已经体内外实验和临床实验证实对伊马替尼耐药的患者有效。因此，应用分子遗传学手段及早对患者的疗效做出准确的判断和预测，可以使患者从其他治疗方法中受益。

目录

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符号说明

论文一应用实时定量RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者伊马替尼治疗过程中BCR-ABL mRNA水平及其变化

论文二慢性期CML患者外周血凋亡相关基因mRNA转录水平与伊马替尼疗效关系的研究

论文三CML患者伊马替尼耐药机制的基础与临床研究

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致 谢

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