哈氏噬纤维菌的Tn4351插入突变及突变子筛选与分析

摘要

哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)是一类广泛分布的降解纤维素细菌，由于其能独特的高效降解结晶纤维素而被美国能源部列入微生物基因组研究计划，并于2005年完成了全基因组序列的测定。 哈氏噬纤维菌虽然能在贫瘠的环境中迅速彻底地降解结晶纤维素，但是却不易在葡萄糖碳源琼脂平板上生长，生长条件特殊，能利用的可溶性碳源范围狭窄，所以对其纤维素降解机制的研究主要停留在表面现象，一直很难深入研究。本论文通过利用单独灭菌或过滤除菌的葡萄糖做碳源，降低琼脂浓度的方法，使哈氏噬纤维菌在琼脂平板上生长条件得到改善。哈氏噬纤维菌在0.5％agar,0.22μm微孔滤膜过滤或者115℃，30min高压灭菌的葡萄糖为碳源的平板上能够长出单菌落。这为哈氏噬纤维菌的下一步研究提供了有利条件。 本论文优化了哈氏噬纤维菌的遗传转化操作系统，对多个影响哈氏噬纤维菌遗传操作的因素进行了探索。在接合的过程中，感受态细胞的制备是一个关键因素，渗透压，接合的时间和温度都影响转化效率。以对数中期的细胞为感受态细胞，生理盐水或者 TC buffer 洗涤细胞，28℃接合24h，转化效率达到1.5×10-6左右。这种接合方式是建立在优化了平板生长条件的基础上，克服了在滤纸上生长的局限性，能得到大量的突变子。本论文利用转座子Tn4351随机插入突变建立了一个突变子库。目前大约有1000个菌株。 对纤维素的高效降解是哈氏噬纤维菌的一个明显特征，本论文根据该菌在葡萄糖和纤维素平板上生长现象的不同，设计了一种混合碳源筛选平板(0.05％GLUCOSE+1％CF-11)，根据透明圈的大小或不产透明圈可以筛选得到纤维素降解能力减弱或不能降解纤维素的菌株。另外发现0.05％葡萄糖的添加也促进了哈氏噬纤维菌的生长，该方法减少了传统缺陷菌株筛选方法的烦琐过程，提高了筛选效率。 根据是否降解纤维素，CMC酶活测定和完全降解滤纸的时间等方法发现两株纤维素降解能力降低的菌株27号和31号突变子。其中27号突变子酶活降低20.7％，滤纸降解时间比哈氏噬纤维菌慢一个星期左右。通过DNAMAN，BLAST等软件对其进行了序列分析，发现27号突变子属于还未确定功能的蛋白的插入失活体，该蛋白在纤维素降解中是否起作用以及如何起作用，还需进一步实验证明。31号突变子酶活降低40.7％，滤纸降解时间比哈氏噬纤维菌慢13天左右。通过DNAMAN，BLAST等软件对其进行了序列分析，发现31号突变子属于还未确定功能的蛋白的插入失活体，预测是一种分泌性蛋白，是否是哈氏嗜纤维菌纤维素酶系的组成部分之一还有待于验证。 滑动性是哈氏噬纤维菌的另一个重要特性，也是本论文筛选的突变子特性之一。 本论文筛选得到两株滑动性增强的突变子39号和212号突变子，其中39号突变子从表观现象上看，CMC内切酶活升高25.08％，从而从一方面表明哈氏噬纤维菌的多糖利用与其滑动性相关。39号突变子属于一种转录调节因子的失活突变体。其滑动现象类似于粘细菌的S型滑动。212号突变子能够降解滤纸。212号突变子属于DNA解旋酶超家族I失活突变体。212号突变子滑动性类似于粘细菌的A型滑动。 这些突变子的发现对我们进一步研究哈氏噬纤维菌的纤维素降解机制，滑动机制以及其纤维素降解与滑动性之间的关系具有重要意义。

目录

论文说明：论文中的缩写词表

声明

摘要

第一章前言

1.1纤维素降解研究的意义

1.2纤维素

1.2.1纤维素的结构

1.2.2纤维素的性质

1.2.3纤维素利用中存在的问题

1.3降解纤维素的微生物

1.3.1纤维素降解真菌

1.3.2纤维素降解细菌

1.3.3纤维素降解放线菌

1.4纤维素降解机制的研究

1.4.1纤维素降解终产物

1.4.2结晶纤维素的降解

1.5噬纤维菌的研究背景

1.5.1噬纤维菌属的系统学地位

1.5.2噬纤维菌生长上的特性

1.5.3噬纤维菌滑动机制的研究

1.5.4噬纤维菌特殊的生理生化特性

1.6论文设计

第二章哈氏噬纤维菌生长条件的优化

2.1材料与方法

2.2结果与讨论

2.2.1哈氏噬纤维菌生长曲线的绘制

2.2.2葡萄糖灭菌方式对哈氏噬纤维菌生长的影响

2.2.3琼脂浓度对哈氏噬纤维菌生长的影响

2.3 小结

第三章遗传转化操作体系的建立

3.1材料与方法

3.2结果与讨论

3.2.1哈氏噬纤维菌的药敏实验

3.2.2渗透压对哈氏噬纤维菌生长的影响

3.2.3电转化

3.2.4细菌接合试验

3.2.5生长状态对转化效率的影响

3.2.6渗透压对转化效率的影响

3.2.7温度与时间对转化效率的影响

3.2.8哈氏噬纤维菌突变子库的建立

3.3 小结

第四章纤维素降解突变菌株的筛选及分析

4.1材料与方法

4.2结果与讨论

4.2.1葡萄糖浓度对哈氏噬纤维菌生长的影响

4.2.2哈氏噬纤维菌在微晶液体培养基中不同生长时期不同菌体浓度的内切酶活曲线

4.2.3 DNS法测定突变菌株的CMC内切酶活的变化

4.2.4降解滤纸时间实验

4.2.5突变子的分子生物学验证

4.2.6 27和31号突变子的插入片段侧翼基因的测序及分析

4.3小结

第五章滑动性变化菌株的筛选

5.1材料与方法

5.2结果与讨论

5.2.1菌落在不同琼脂浓度的培养基上的扩散

5.2.2 39号和212号突变子插入突变的分子生物学验证

5.2.3 39号突变子插入片段侧翼基因的测序及序列分析

5.2.4 212号突变子插入片段侧翼基因的测序及序列分析

5.3 小结

第六章全文总结

参考文献

致谢