农杆菌介导的瑞氏木霉T-DNA插入突变及生长代谢突变子分析

摘要

瑞氏木霉(Trichoderma reesei，anamorph：Hypocrea，jecorina)是具有重要经济价值的工业丝状真菌，可以用于生产纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶等多种酶类，‘这些酶类已广泛应用于纺织、造纸、制浆等工业领域。同时，由于具有很强的蛋白分泌能力，该菌已被开发成为表达同源蛋白和异源蛋白的良好真核宿主。多样化的代谢能力、对人没有毒性以及生长快、无性繁殖等竞争性生长是瑞氏木霉的重要特征。目前，瑞氏木霉全基因组测序工作已经完成，这对深入了解这个经济重要的工业菌株具有重大意义，同时也为鉴定那些与该菌生长、代谢相关的关键基因提供了良好平台。利用分子标签技术获得突变体己成为进行基因克隆和遗传学分析最有效的方法之一。因此，建立瑞氏木霉基因标签的插入突变体库是功能基因组学发展的趋势，而对不同表型突变体的正、反向遗传学分析可以促进揭示瑞氏木霉生长、代谢的分子机理。 本论文研究的目的在于建立和优化根癌农杆菌介导的瑞氏木霉转化系统，利用T-DNA随机插入突变建立瑞氏木霉的突变体库；采用反向遗传学和正向遗传学方法相结合的策略对突变株进行变异性状的分析和基因水平的研究，鉴定那些与突变性状相关的新基因；选择那些控制瑞氏木霉生长、发育或重要代谢途径的关键基因发生插入突变的突变株进行生理、生化和分子遗传学的研究，深入了解基因的功能和阐明相关的分子机理。 1．农杆菌介导的瑞氏木霉转化及T-DNA插入突变分析本文用农杆菌AGL1成功介导转化了丝状真菌瑞氏木霉QM9414，T-DNA随机插入到瑞氏木霉染色体中，并得到了一批瑞氏木霉T-DNA插入突变体。将pAN7-1质粒的HPH基因表达盒插入到Ti质粒pB1121中，获得了双元载体pBI-hph。该载体导入农杆菌AGL1后，在乙酰丁香酮的诱导下，瑞氏木霉原生质体或孢子与农杆菌共培养产生了具有潮霉素抗性的转化子，转化效率较高，并筛选到了稳定的转化子。从随机挑选的9个转化子的PCR和杂交分子验证表明，T-DNA上的HPH基因己插入到瑞氏木霉染色体中。借助于TAIL-PCR方法，从转化子中成功克隆到了T-DNA插入位点侧翼序列，序列分析证明T-DNA是随机插入到瑞氏木霉染色体中的。目前已获得分子验证的突变菌株200余株，以平板为单位收集的抗性稳定的瑞氏木霉转化子数十板，初步建立起小范围的瑞氏木霉T-DNA标签的插入突变体库。实验结果表明，农杆菌介导转化(AMT)瑞氏木霉是一种有效的插入突变策略，对于瑞氏木霉功能基因组学的研究具有重要意义。 2．瑞氏木霉生长发育异常突变子的筛选和分析对瑞氏木霉T-DNA标签的突变子库进行表型筛选，发现了7株形态异常的突变子。在这些突变子中，有两个突变子的T-DNA插入位点恰好位于同一个基因的不同位点。序列比对和系统分析发现,该基因编码类胡萝卜素双加氧裂解酶(CCD，carotenoid cleavage dioxygenase)，命名为TrCCDl，该基因位点的突变产生了与形态发生和生孢相关的异常表型。序列分析和实验验证表明，这两个突变子的T-DNA分别位于TrCCDl的开放阅读框(ORF)和启动子区(promotor)，因此，分别命名为ccdO和ccdP。突变子ccdO和ccdP与出发菌株QM9414相比，在MM平板上生长缓慢，生长速率仅为出发菌株的1／2左右，同时菌落相对疏松；当在含0.2﹪Triton X-100的MM平板上生长时，突变子菌落形成了一些长的气生菌丝，导致菌落蓬松；菌丝的显微观察发现，突变子的菌丝顶端与菌丝中间区域相比明显变化，菌丝顶端颜色变暗；突变子PDA平板培养4d后仅有中间部位产生稍许绿色孢子，而周边都是白色菌丝，与QM9414形成鲜明对比生孢比较困难。为了确定菌株类胡萝卜素的变化情况，利用丙酮对分泌到培养基的类胡萝卜素进行吸光度检测和β胡萝卜素的高效液相色谱(HPLC)测定。测定445nm处类胡萝卜素吸光度值，发现QM9414的类胡萝卜素吸光度值仅为突变菌株的1/2左右；高效液相色谱法测定451nm处β胡萝卜素的色谱，根据峰面积和β胡萝卜素浓度关系，计算β胡萝卜素含量。结果发现，突变子分泌到PDA培养基中的B胡萝卜素含量比出发菌株’QM9414低的多(约为1/2)。本实验的结果表明，TrCCDl基因的突变与类胡萝卜素的含量直接相关，TrCCDl在类胡萝卜素的代谢中具有重要作用。由此推测，它的突变可能影响了某种具有重要信号作用的类胡萝卜素分子的生成，因而导致了瑞氏木霉菌丝生长和孢子发育的异常，这也说明属于CCD家族成员的TrCCD1基因在生长发育过程中起到了重要的调控作用。表型筛选获得的另外5株形态异常的突变子为：PM2、PM48、HP7、HP13和HPL1。对这些突变子的一般形态进行了分析并利用TAIL-PCR.对突变菌株染色体T-DNA插入位点侧翼序列进行了克隆。5株突变子的菌落形态各异，与出发菌株有明显区别，菌丝延伸较慢，有的菌落成明显辐射状，有的菌落白色，根本没有生孢迹象等。尤其值得关注的是PM2，它的菌丝顶端弯曲缠绕，形成了一个个卷曲成团的头部。目前，TAIL-PCR已经扩增到PM48和HPL1的插入位点序列。PM48的插入位点在一个编码细胞周期相关蛋白的基因ORF区。HPLl的插入位点基因编码的蛋白可能是一个多聚腺苷酸结合蛋白，该基因的突变引起了纤维素降解能力的变化。 3.纤维素降解突变菌株的筛选和分析利用CFll平11板透明圈筛选法，对200余株经分子验证的T-DNA插入突变子进行了筛选，结果发现了4株纤维素降解突变子：PM3、PM23、HPL1和36H-6。其中，突变子PM3和PM23的透明圈增大了30﹪左右，而HPL1和.36H-6的透明圈减小了40﹪左右，并且36H-6形不成完整的透明圈。通过纤维素酶活力测定发现，各菌株的FPA活力在18h至24h之间达到高峰期，其中PM3和PM23的FPA最高活力比出发菌株高30﹪以上，且PM3比其它菌株提前达到酶活最大值，PM23的FPA活力持续时间最长的。另外两个突变子ItPL1和36H-6的FPA活力始终低于QM9414，尤其是HPL1的FPA活力一直处于较低水平，最高酶活比出发菌株低了近2/3，而36H-6的最高酶活与出发菌株相差不大，但其酶活力随着时间延长下降很快，48h时就几乎丧失了活力。各菌株的CMCase都是在24h达到酶活高峰，PM3和PM23的最大CMCase活力比出发菌株高，而HPL1和36H-6比出发菌株低，但活力最高的是PM23而不是PM3。尤其值得注意的是，HPL1的FPA和CMCase活力都始终处于较低水平。利用TAIL-PCR从HPL1菌株的T-DNA右端RB区扩增到了T-DNA侧翼基因组序列，经与数据库的比对分析发现，该突变基因编码的蛋白可能是多聚腺苷酸结合蛋白，突变位点位于基因上游-26bp处。该基因的功能与RNA加工和修饰有关。 4．绿色荧光蛋白标记的双元载体构建及农杆菌转化本文也构建了两个不同Ti质粒载体系统的绿色荧光蛋白为标记的双元载体，并进行了初步的农杆菌介导转化瑞氏木霉的实验。pBI-gfp载体是一个中间质粒，它是由四片段连接构建成的，含有EGFP表达盒。然后将该表达盒经过酶切和末端平滑化后插入到携带潮霉素的Ti质粒pBI-hph中，以此实现了双标记载体pBI-gh的构建。但是，从农杆菌转化瑞氏木霉结果看，没有检测到绿色荧光。在转化过程中也出现过一些问题，例如pBI-gh在转化到农杆菌后在扩增EGFP基因时得到的DNA片段总是减小等，我们纯化了农杆菌菌株这一问题得到了解决，但仍然没有检测到绿色荧光，其原因不清楚。 本文又利用另-Tj质粒pCMBIA1301为骨架和piG1783质粒的绿色荧光蛋白表达盒构建了新的双元载体pCB-hg。由于该GFP已经成功地在一些真菌中得到了表达，所以由该表达盒构建成地pCB-hg双元载体是有希望获得荧光蛋白表达的载体。该双元载体的转化农杆菌己经完成，农杆菌介导真菌转化的工作正在进行。

目录

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符号说明

第一章绪论

1.1瑞氏木霉

1.2丝状真菌功能基因组学研究概况及策略

1.2.1比较基因组学

1.2.2丝状真菌的转化技术

1.2.3连续基因敲除方法

1.2.4转座子标签技术

1.2.5 REMI技术

1.2.6 RNAi技术

1.2.7丝状真菌蛋白质组学研究

1.2.8丝状真菌功能基因组学研究的其它相关技术

1.3农杆菌介导转化(AMT)丝状真菌研究进展

1.3.1 AMT技术的分子基础

1.3.2 AMT技术应用于正向和反向遗传学研究

1.3.3 T-DNA插入位点侧翼序列的克隆及分离

1.3.4农杆菌介导的T-DNA随机插入突变

1.3.5农杆菌介导的基因定向突变

1.3.6 AMT技术应用于功能基因组学的优点

1.3.7 T-DNA插入突变的问题

1.4丝状真菌突变子筛选的研究

1.4.1代谢突变子的筛选

1.4.2菌丝顶端生长缺陷突变子的筛选

1.4.3有丝分裂突变子的筛选

1.4.4发育突变子的筛选

1.4.5减数分裂突变子的筛选

1.4.6其他突变子的筛选

1.5纤维素酶研究进展

1.5.1纤维素酶系组分

1.5.2纤维素酶的结构

1.5.3纤维素酶降解机制

1.5.4纤维素酶基因的诱导和调控

1.5.5纤维素酶高产菌种选育

1.6类胡萝卜素氧化裂解酶研究进展

1.7本论文研究意义及主要内容

第二章农杆菌介导的瑞氏木霉转化及T-DNA插入突变分析

2.1引言

2.2实验材料和方法

2.2.1菌株和质粒

2.2.2培养基和培养条件

2.2.3菌种保藏技术

2.2.4主要分子实验试剂

2.2.5重组DNA技术

2.2.6引物设计及PCR扩增条件

2.2.7 pBI-hph载体的构建

2.2.8农杆菌感受态细胞的制备与转化

2.2.9瑞氏木霉原生质体的制备

2.2.10农杆菌介导转化丝状真菌瑞氏木霉

2.2.11瑞氏木霉染色体提取

2.3实验结果和讨论

2.3.1 pBI-hph载体的构建结果

2.3.2双元载体pBI-hph转化农杆菌AGL1

2.3.3农杆菌介导的瑞氏木霉转化

2.3.4瑞氏木霉AMT转化子的分子验证

2.3.5 TAIL-PCR克隆T-DNA插入位点侧翼序列

2.3.6 T-DNA插入位点序列特征分析

2.3.7瑞氏木霉T-DNA插入突变体库的建立

2.4小结

第三章瑞氏木霉生长发育异常突变子的筛选和分析

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1菌株和质粒

3.2.2培养基和培养条件

3.2.3主要分子生化实验试剂

3.2.4DNA操作方法

3.2.5 ccd突变子筛选及生长发育特征分析

3.2.6 TrCCD1基因的克隆、特征及分析

3.2.7菌丝形态观察

3.2.8类胡萝卜素含量测定

3.2.9高效液相色谱法(HPLC)测定β胡萝卜素含量

3.2.10丝状真菌自主复制质粒pME-tcl的构建及互补实验

3.3实验结果与讨论

3.3.1 ccd突变子的分离和TrCCD1基因的鉴定

3.3.2 T-DNA插入TrCCD1基因位点分析

3.3.3突变子ccdO和ccdP的表型特征

3.3.4突变子ccdO和ccdP的生孢特征

3.3.5类胡萝卜素分泌量测定

3.3.6高效液相色谱(HPLC)测定β胡萝卜素含量

3.3.7互补实验

3.3.8其它形态突变子筛选及分析

3.4小结

第四章纤维素降解突变菌株的筛选和分析

4.1引言

4.2材料和方法

4.2.1菌株

4.2.2培养基和培养方法

4.2.3主要仪器及试剂

4.2.4 DNS法测定还原糖(葡萄糖)的标准曲线制作

4.2.5滤纸酶活力(FPA，Filter Paper Activity)测定

4.2.6 CMC-Na酶活力(内切纤维素酶活力)测定

4.2.7基因克隆及同源性比较

4.3实验结果与讨论

4.3.1纤维素降解突变菌株的初步筛选

4.3.2突变菌株的滤纸酶活力（FPA）分析

4.3.3突变菌株的CMCase活力分析

4.3.4纤维素降解突变菌株的突变基因克隆及分析

4.4小结

第五章绿色荧光蛋白标记的双元载体构建及农杆菌转化

5.1引言

5.2实验材料和方法

5.2.1菌株和质粒

5.2.2培养基和培养条件

5.2.3主要分子实验试剂

5.2.4重组DNA技术

5.2.5引物设计及PCR扩增条件

5.2.6 pBI-gh载体的构建

5.2.7 pCB-hg载体的构建

5.2.8农杆菌感受态的制备与转化

5.2.9农杆菌介导转化丝状真菌瑞氏木霉

5.2.10瑞氏木霉染色体振荡破壁法快速小量提取

5.3结果与讨论

5.3.1 pBI-gfp载体的构建结果

5.3.2双元载体pBI-gh的构建结果

5.3.3双元载体pBI-gh转化农杆菌AGL1

5.3.4含pBI-gh双元载体的农杆菌AGL1介导的瑞氏木霉转化

5.3.5双元载体pCB-hg的构建结果

5.3.6双元载体pCB-hg转化农杆菌AGL1

5.3.7含pCB-hg双元载体的农杆菌AGL1介导的瑞氏木霉转化

5.4小结

参考文献

致谢

攻读学位期间已(待)发表的学术论文目录

在校期间所获奖励

外文论文一

外文论文二