siRNA对视网膜母细胞瘤血管内皮生长因子基因抑制作用的实验研究

摘要

目的：视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤。传统的治疗方法包括眼球摘除术、光凝治疗、冷冻治疗、外放射治疗等。但上述各种方法均有其各自不足之处。因此，有关视网膜母细胞瘤发生机制和治疗措施的基础与临床研究一直是研究的热点，其中重要课题之一即是视网膜母细胞瘤的血管生成和抗血管生成治疗问题。 血管发生对于肿瘤形成和维持是非常重要的，血管发生的调节是一个复杂的过程，在这个过程中，肿瘤细胞和新血管系统通过自分泌和旁分泌的生长因子相互作用，依赖于血管发生的视网膜母细胞瘤是高度致死性的癌症，治疗有效性的提高要求我们进一步了解促进视网膜母细胞瘤血管发生的分子机制。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）对内皮细胞的分裂和迁移具有激活作用并引起血管生成，是近年来研究的焦点。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。现已证实RNA干扰是一个依赖ATP的过程，在此过程中，dsRNA（外源的或体内产生的）首先被降解为具5’-单磷酸、长21～23bp的小分子双链RNA，这种RNA分子称为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），siRNA通过碱基互补配对识别具同源序列的mRNA，并介导其降解。 本研究利用RNA干扰技术，探讨血管内皮生长因子编码基因的siRNA对人视网膜母细胞瘤细胞的影响，从而探讨通过抑制血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤组织中的表达来治疗视网膜母细胞瘤的机理。 材料和方法：视网膜母细胞瘤细胞株购自中南大学湘雅医学院，将其放入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，取对数生长期的细胞用于实验。 （1）视网膜母细胞瘤细胞进行传代培养，光镜下观察细胞形态。 （2）根据转染复合物浓度分为正常对照组（只加脂质体）、阴性对照组（脂质体+阴性siRNA oligo）和siRNA转染组（脂质体+siRNA oligo），采用LipofectamineTM2000脂质体转染法，将血管内皮生长因子特异性的siRNA转染入视网膜母细胞瘤细胞。 （3）逆转录.聚合酶链反应（RT-PCR）法检测RB细胞血管内皮生长因子mRNA的表达。 （4）Western-blot法检测RB细胞血管内皮生长因子蛋白表达。 （5）MTT法检测VEGF特异性siRNA对RB细胞生长的影响。 （6）RNA干扰后RB细胞caspase-3活性检测。 结果： （1）光镜下，传代培养的视网膜母细胞瘤细胞呈圆形。 （2）VEGF特异性siRNA对RB细胞VEGF mRNA表达的影响在RB细胞中，与只加入LipofectamineTM 2000脂质体的正常对照组和阴性对照组比，VEGF特异性siRNA可以明显抑制VEGF基因的表达。经计算机分析条带的灰度值，VEGFmRNA在正常对照组RB细胞中的相对表达量为0.923±0.03；在阴性对照组的相对表达量为0.875±0.05，在siRNA转染组的相对表达量为0.314±0.02，差异有统计学意义（P<0.01）。 （3）VEGF特异性siRNA对RB细胞VEGF蛋白表达的影响与正常对照组和阴性对照组相比，转染组的VEGF蛋白表达水平明显降低，说明siRNA成功的抑制了VEGF蛋白的表达。 （4）MTT结果显示VEGF特异性siRNA对RB细胞具有增殖抑制作用。 （5）Caspase-3活性检测显示VEGF特异性siRNA组RB细胞其活性是对照组的约4.8倍。 结论： 体外化学合成的siRNA能有效的转染视网膜母细胞瘤细胞。血管内皮生长因子特异性siRNA对视网膜母细胞瘤细胞血管内皮生长因子基因的表达有抑制作用，其作用机理为RNA干扰技术的特异性基因沉默作用。从而为VEGF成为视网膜母细胞瘤基因治疗靶点的可行性提供了依据。

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结 论

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