细胞色素P450 2E1增强顺铂肝毒性的机理研究

摘要

本研究旨在探讨升高的CYP2E1对顺铂诱导的肝损伤的影响。本研究采用的实验动物为雄性C57BL-6小鼠，随机分为2组，分别为对照组和CYP 2E1诱导组，后者喂含2％丙酮的自来水7天以诱导CYP2E1。对照组和CYP 2E1诱导组再分别分为2组，即顺铂组和对照组，前者经腹腔注射顺铂45 mg/kg。24小时后处死动物，并取样检测。结果显示，喂丙酮水的小鼠CYP2E1活性比对照小鼠升高1倍；Westernblot分析表明CYP2E1蛋白含量升高1.5倍。小鼠腹腔注射45mg/kg的顺铂可诱导血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)分别升高2倍和4倍。在丙酮顺铂联合组，血清ALT和AST比单纯顺铂组分别高1倍和40％。单纯顺铂组病理检查显示明显的细胞变性，但无细胞坏死；在丙酮顺铂联合组，可见广泛的细胞坏死。顺铂可诱导Caspase-3活性升高1倍，TUNEL染色阳性率约5％，丙酮顺铂联合组Caspase-3活性进一步升高大约30％，TUNEL染色阳性率则升高到13％。为进一步证明丙酮是通过CYP2E1增强顺铂的肝毒性，在实验中引入CYP2E1基因敲除小鼠。SV129背景的CYP2E1基因敲除小鼠及其野生型正常对照小鼠喂含2％丙酮的自来水7天后腹腔注射45mg/kg的顺铂，结果显示CYP2E1基因敲除小鼠的血清ALT和AST比野生型正常对照小鼠分别低约40％和30％，TUNEL和Caspase-3阳性染色也低于对照小鼠。以上结果证明CYP2E1在丙酮增强顺铂肝毒性的过程中起重要作用。如果丙酮增强顺铂的肝毒性是由于其诱导的CYP2E1，那么可能的机制是CYP2E1介导的氧化应激和顺铂介导的氧化应激协同，从而增强了肝毒性。脂质过氧化产物丙二醛(MDA)和4-羟烯(HAE)在单纯顺铂组升高25％(P<0.05)，而丙酮顺铂联合组则进一步升高20％(P<0.05)。蛋白羰基形成是蛋白氧化损伤的早期指标。单纯顺铂组可检测到明显升高的蛋白羰基形成，而丙酮顺铂联合组则更高于单纯顺铂组。一氧化氮(NO)和O2可快速发生反应产生过氧亚硝酸盐(ONOO-)，后者可使酪氨酸硝基化形成3-硝基酪氨酸(3-NT)。单纯顺铂组可检测到较弱的3-NT，丙酮顺铂联合组则强于单纯顺铂组。铁是自由基形成的催化剂，单纯顺铂组可检测到较弱的铁染色，丙酮顺铂联合组则强于单纯顺铂组。以上结果表明丙酮诱导CYP2E1升高的同时可增强顺铂的肝毒性，在此过程中氧化应激可能起重要作用。 为进一步深入研究CYP2E1增强顺铂的肝毒性的机制，我们利用转染并表达人CYP2E1的HepG2细胞(E47细胞)和只转染了空载体而不表达人CYP2E1的HepG2细胞(C34细胞)建立CYP2E1促进顺铂肝脏毒性的体外细胞模型。同样浓度的顺铂孵育同样时间，C34细胞毒性明显小于E47细胞。为验证E47细胞对顺铂更敏感可能与细胞内的CYP2E1促进顺铂诱导的氧化应激有关，我们检测了细胞内谷胱甘肽(GSH)含量和活性氧类(ROS)产生量。顺铂使E47和C34细胞GSH含量均下降，而E47细胞下降的幅度更大。顺铂可致E47和C34细胞ROS产生量上升，而E47细胞上升的幅度更大。这些结果表明，顺铂诱导的氧化应激在E47细胞比C34细胞更明显。为进一步证明氧化应激的作用，我们用抗氧化剂和助氧化剂做干预试验。DL-甲硫氨酸磺酰亚胺(BSO)系GSH耗竭剂，能促进顺铂诱导的E47和C34细胞毒性，但对E47细胞毒性的促进作用更大。谷胱甘肽乙酯(GSHE)能很容易地被细胞摄取，然后在细胞内被代谢成GSH；去铁敏(DFO)是铁鳌合剂，可预防铁催化的更强氧化剂如羟自由基的产生。GSHE和DFO都可使顺铂诱导的E47细胞毒性下降，表明顺铂诱导的E47细胞毒性与氧化应激有关。二稀丙基硫化物(DAS)是CYP2E1的抑制剂，也能降低顺铂诱导的E47细胞毒性，提示CYP2E1在顺铂诱导的E47细胞毒性中的重要作用。 为探讨MAPK在顺铂细胞毒中的作用，E47和C34细胞分别用P38MAPK、JNK和ERK的抑制剂P38MAPK抑制剂(SB203580)、JNK抑制剂(SP600125)和ERK抑制剂(U0126)预先处理1小时，然后再加不同浓度的顺铂，24小时后用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率。三种MAPK抑制剂中，只有ERK抑制剂U0126能降低顺铂诱导的E47和C34细胞毒，表明ERK可能在顺铂细胞毒中起作用。为证明ERK确实被活化，我们检测ERK的活化形式p-ERK。无论是E47细胞还是C34细胞，顺铂都诱导ERK活化，U0126也抑制该活化作用，表明U0126确实是通过抑制ERK活化来抑制顺铂细胞毒。虽然E47细胞对顺铂比C34细胞更敏感，但是ERK活化幅度并没有明显不同。推测ERK活化时间的早晚可能是一重要因素，所以进一步观察ERK活化的时间进程。由于0.25mM浓度的顺铂作用24小时只造成E47细胞毒性，而不引起C34细胞毒性，所以我们采用0.25 mM浓度的顺铂。无论是E47细胞还是C34细胞，顺铂都诱导较持久的ERK活化，但在E47细胞ERK．活化得更早一些。为进一步探讨ERK的早期活化对E47细胞敏感性的作用，在加顺铂之后不同时间加U0126，再检测其对顺铂细胞毒性的影响。在加顺铂1、2、4、8小时之后加U0126，对两种细胞都有防护作用，但在加顺铂16小时之后再加U0126，只可降低顺铂对C34细胞的毒性而不能降低其对E47细胞的毒性。以上结果表明，ERK的持久激活在顺铂诱导E47和C34细胞毒作用中都起重要作用，而ERK早期活化使E47细胞对顺铂更敏感。 如上所述，顺铂可诱导ROS的产生，而BSO可增强顺铂诱导的ROS产生;U0126和GSHE均可降低被顺铂或BSO与顺铂联合诱导的ROS产生，因而可保护顺铂或BSO与顺铂联合诱导的细胞毒。为进一步评价ROS在细胞死亡模式转化中的作用，我们又观察了几种抗氧化剂对其作用。BSO与顺铂联合诱导的坏死可被超氧化物阴离子自由基清除剂MnTMP、维生素E类似物Trolox、铁鳌合剂DFO和GSH补充剂GSHE等防护，各种抗氧化剂保护效果类似，表明氧化应激在BSO与顺铂联合诱导的坏死中起重要作用。但是，除了GSHE外，其它抗氧化剂都没有将BSO与顺铂联合诱导的坏死转化为凋亡，提示GSHE对细胞死亡模式的转化作用不是因为其抗氧化作用。GSHE与其它抗氧化剂比较，一个重要的不同是GSHE含巯基，而其它抗氧化剂不含巯基。Caspase是半胱氨酸蛋白酶，在其活性中心含有的半胱氨酸残基是维持其活性所必需的。GSH可调节细胞内氧化还原状态，预防半胱氨酸的巯基被氧化修饰而使酶失活。因而推测，细胞内GSH被BSO降低后，Caspase中半胱氨酸的巯基被氧化，故而Caspase酶失活，细胞毒性表现出的不是凋亡而是坏死。相反，GSHE可阻止或恢复半胱氨酸巯基的氧化，因而可将坏死又转化为凋亡。结果发现，GSHE确实可升高BSO与顺铂联合诱导的caspase活性下降，检测细胞内GSH发现GSHE果然可升高细胞内GSH。上述结果表明细胞内GSH对维持caspase活性和将BSO与顺铂联合诱导的坏死转化为凋亡起重要的作用。 虽然U0126可部分将BSO与顺铂联合诱导的坏死转化为凋亡，也可恢复或升高caspase活性，但我们未观察到U0126对细胞内GSH含量有影响。这提示可能有另一种来源的巯基可代替GSH调整细胞内氧还状态。我们检测了细胞内硫氧还蛋白(TRX)。TRX是另一巯基还原剂，与GSH有互补作用。在E47细胞，顺铂使TRX表达急剧下降，BSO与顺铂联合则使TRX表达进一步下降；但是在C34细胞，TRX表达没有任何变化。U0126可恢复顺铂或BSO与顺铂联合诱导的TRX表达下降。GSHE也可部分恢复顺铂或BSO与顺铂联合诱导的TRX表达下降。为证明TRX的作用，我们用TRX siRNA降低E47细胞TRX表达，再经顺铂或BSo与顺铂联合处理。和非特异性对照siRNA相比，TRX siRNA可抑制TRX在E47细胞的表达，U0126也不能恢复被TRX siRNA抑制的TRX表达，TRX表达被TRX siRNA抑制后，顺铂细胞毒性增强，被BSO与顺铂联合处理所抑制的caspase-3活性没有进一步下降，但可部分阻止U0126对caspase-3活性的恢复作用，类似地，U0126对凋亡的恢复作用也被部分阻止。由上可推测，U0126不仅可抑制ERK的活化，还可上调TRX的表达，当GSH被BSO降低时，TRX可代替GSH维护caspase的活性，使U0126对坏死既有防护作用又可部分将坏死转化为凋亡。至于U0126如何上调TRX的表达，有待进一步研究。 本研究体内与体外试验的结果表明，升高的CYP2E1能增强顺铂诱导的肝毒性，其机制可能与升高的ROS产量和氧化应激有关。采用过表达CYP2E1的HepG2细胞，顺铂诱导较早而持久的ERK活化，ERK的活化可促进ROS的产生，而ROS又可进一步激活ERK，如此互相促进，从而导致更严重的细胞损伤。顺铂可诱导HepG2细胞坏死和凋亡，而ERK的活化可促进顺铂诱导的坏死而不是凋亡。谷胱甘肽被BSO耗竭后，顺铂诱导的细胞凋亡转化为坏死，巯基抗氧化剂使顺铂诱导的细胞坏死又可转化为凋亡，而其它非巯基抗氧化剂则不能。硫氧还蛋白可代替谷胱甘肽促进顺铂和BSO诱导的细胞坏死转化为细胞凋亡；ERK可促进顺铂诱导的硫氧还蛋白下降而促进顺铂和BSO诱导细胞坏死。

目录

论文说明：缩略词表

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摘要

前言

第一部分细胞色素P450 2E1增强顺铂诱导的小鼠肝毒性

第二部分CYP2E1促进顺铂对HepG2细胞的毒性：ROS和ERK的作用

第三部分顺铂诱导的E47细胞死亡模式：ERK、ROS、GSH和硫氧还蛋白的调节作用

综述细胞色素P450 2E1和氧化性肝损伤

博士在读期间发表的论文

致谢