猪α-干扰素的原核表达及其活性测定

摘要

近些年来，猪的病毒性疾病时常危害着养猪业的正常发展，研究表明猪α-干扰素具有显著的抗病毒功能，对猪的很多种病毒性传染病，如流行性腹泻、猪瘟、蓝耳病、传染性胃肠炎等都有一定防治效果。目前，利用基因工程手段研制和开发重组干扰素制剂已成为研究热点，并已有多种类型干扰素产品成功上市，但仍远远满足不了市场需求。本文对猪IFN-α密码子序列进行了优化改造，并采用原核表达系统对猪IFN-α成功进行了表达，纯化及抗病毒活性研究，为重组猪IFN-α的生产和应用打下了基础。 一、猪α-干扰素基因序列的改造与克隆 本研究在前期获得猪IFN-α基因序列的基础上，根据大肠杆菌的偏嗜性，对其密码子序列进行改造。改造后的猪IFN-α-基因序列与原序列相比，碱基改变79个，占全基因序列的16％；密码子改变63个，占总密码子数的38％;基于原序列中含有5个编码半胱氨酸的密码子，为防止蛋白折叠中二硫键的错配，将第86位半胱氨酸密码子(UGC)改造为酪氨酸密码子(UAC)，使得Cysl-Cys99，Cys29-Cys139之间形成两个分子内二硫键。改造后序列以引物的形式分段合成，采用重叠延伸PCR(SOE PCR)进行依次扩增，并最终获得改造后的猪IFN-α全基因序列；将改造后的猪IFN-α基因克隆到pMT-Easy载体中，酶切及测序鉴定结果表明成功构建克隆载体pMT-poIFN-α。 二、重组猪α-干扰素的原核表达、鉴定与纯化 重新设计引物，并引入Ndel、EcoRI酶切位点，构建重组猪α-干扰素的原核表达载体pET28-poIFN-α，酶切及测序鉴定正确后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，添加IPTG诱导表达；经SDS-PAGE分析，在相对分子质量约21kDa的位置出现明显的新生蛋白条带，与目的蛋白分子量大小相近，采用Western Blot对其进一步进行鉴定后，表明重组猪α-干扰素成功获得了表达。目的蛋白为N端带有(His)6标签的融合蛋白，主要以包涵体形式存。对表达条件(诱导时间、温度及IPTG浓度)进行优化后，目的蛋白占到菌体总蛋白的39.8％，实现了重组猪α-干扰素在大肠杆菌中的高效表达。表达产物经镍琼脂糖亲和层析方法进行纯化后，目的蛋白纯度达到90％以上，获得了较高纯度的重组猪α-干扰素。 三、重组猪α-干扰素抗病毒活性研究 纯化后的重组猪α-干扰素经流加稀释法复性后，采用MDBK/VSV与PK15/VSV系统分别鉴定了重组猪α-干扰素的抗病毒活性，并采用微量细胞病变抑制法，通过MDBK/VSV系统测定了重组猪α-干扰素的抗病毒活性效价约为2.19×106 U/mg，获得了具有较高活性的重组猪α-干扰素，为重组猪IFN-α的生产和应用打下了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章综述 干扰素的研究进展

1干扰素的概况

2猪α-干扰素的研究进展

参考文献

第二章猪α-干扰素基因的克隆与序列分析

1实验材料

1.1质粒与菌株

1.2工具酶和试剂盒

1.3试剂与培养基

2实验方法

2.1引物的设计

2.2重叠引物PCR法扩增猪α-干扰素全基因

2.3目的基因的克隆

2.4目的基因的序列分析

3实验结果

3.1 SOE PCR扩增结果

3.2酶切鉴定及测序结果

3.3目的基因的序列分析

4讨论

参考文献

第三章猪α-干扰素在大肠杆菌中的表达

1实验材料

1.1质粒与菌株

1.2工具酶与试剂盒

1.3试剂与培养基

2实验方法

2.1引物的设计与目的基因的扩增

2.2原核表达载体pET28-poIFN-α的构建

2.3表达载体pET28-poIFN-α的双酶切鉴定

2.4工程菌的诱导表达

2.5表达产物的SDS-PAGE分析

2.6表达产物的定位

2.7表达产物的Western Blot鉴定

2.8表达条件的优化

2.9包涵体的制备

2.10重组猪α-干扰素的亲和层析纯化

2.11重组猪α-干扰素的复性

2.12蛋白浓度的测定(BCA法)

3实验结果

3.1目的基因的扩增

3.2 pET28-poIFN-α的双酶切鉴定

3.3表达产物的SDS-PAGE分析

3.4表达产物的定位

3.5表达产物的Western Blot鉴定

3.6表达条件的优化

3.7重组猪α-干扰素的亲和层析纯化

3.8蛋白浓度的测定(BCA法)

4讨论

参考文献

第四章重组猪α-干扰素的抗病毒活性研究

1实验材料

1.1细胞、毒株、鸡胚

1.2试剂与培养基

2实验方法

2.1 MDBK(牛肾细胞)和PK15(猪肾细胞)的培养与鸡胚的孵育

2.2 VSV在鸡胚中的扩增

2.3 K(a)rber法测定VSV(水疱性口炎病毒)的TCID50

2.4微量细胞病变抑制法测定重组猪α-干扰素的活性

3实验结果

3.1 K(a)rber法测定VSV(水疱性口炎病毒)的TCID50

3.2重组猪α-干扰素的活性测定

4讨论

参考文献

总结与展望

附录

致谢

攻读学位期间发表的论文