糖酵解途径和转运系统的改造对大肠杆菌发酵L-苏氨酸的影响

摘要

L-苏氨酸是人类必需氨基酸，在医药、食品、饲料领域有广泛的应用。在大肠杆菌高密度发酵过程中，易形成副产物乙酸，抑制菌体生长并且降低L-苏氨酸产量。此外，改造L-苏氨酸转运系统，有利于降低胞内L-苏氨酸浓度，从而解除其对关键酶的反馈作用，可能是提高L-苏氨酸产量的重要策略。
　　大肠杆菌中乙酸生成的主要原因是碳源溢流，即糖酵解代谢流高于TCA循环代谢流，敲除L-苏氨酸生产菌THRD中糖酵解关键酶基因pyk和pfk，减弱糖酵解途径代谢流，以减少溢流碳源进而减少乙酸的生成。利用5L发酵罐进行分批补料发酵实验，结果发现，THRD△pykF，THRD△pykA，THRD△pfkA和THRD△pfkB乙酸浓度分别降为原菌的47.80％、19.54％、1.52％和35.39％。与原菌相比，THRD△pykF和THRD△pykAL-苏氨酸的产量分别提高了11.05％和5.35％(112.57±2.82、106.79±2.80 vs.101.37±2.79g/L)，糖酸转化率分别提高了10.91％和5.60％。THRD△pfkA缺失株因生长缓慢产酸低，THRD△pfkB的产L-苏氨酸水平与原菌THRD相差不大。随后构建了双基因敲除菌THRD△pfkB△pyk，THRD△pfkB△pykF的L-苏氨酸产量与THRD△pykF相差不大，但乙酸积累量降低了21.35％。另外，除了THRD△pfkA的NADPH浓度降低外，其他重组菌株的NADPH生成量均高于原菌。上述结果证明，在THRD中适当的改造糖酵解途径能够有效地减弱糖酵解途径代谢流，减少乙酸生成，进而有益于L-苏氨酸合成。
　　由于大肠杆菌乙酸的生成与糖摄取有很大关系，改造糖转运系统也是减少乙酸的重要策略。以L-苏氨酸生产菌TRFC为出发菌株敲除在糖转运系统中起重要作用的EⅡ CBGlc的编码基因ptsG。摇瓶结果显示，TRFC△ptsG产酸水平与原菌相近，乙酸积累量降低了22.83％。在5L分批补料发酵过程中，其L-苏氨酸产量仅为原菌的58.30％。说明ptsG的敲除能有效地降低乙酸，但不利于大肠杆菌TRFC高产L-苏氨酸。
　　在大肠杆菌中敲除sstT能降低胞外L-苏氨酸吸收速率，过表达rhtC能增加胞内L-苏氨酸的输出速率。构建TRFC sstT基因缺失株，摇瓶发酵结果显示，与原菌相比，其L-苏氨酸产量提高了4.00％。随后在TRFC△sstT重组菌基础上进一步过表达rhtC基因，TRFC△sstT+pSTV28-rhtC的L-苏氨酸产量比TRFC△sstT+pSTV28提高了18.16％。另外，测定了四个菌株的胞内外L-苏氨酸浓度，发现各重组菌株胞内L-苏氨酸浓度低于原菌。最后进行了TRFC△sstT+pSTV28-rhtC的5L发酵罐L-苏氨酸发酵实验，其L-苏氨酸产量及糖酸转化率较原菌分别提高了15.33％和16.14％。实验结果表明，改造L-苏氨酸转运系统，能有效地降低细胞内L-苏氨酸的浓度，增强细胞内L-苏氨酸外排能力，进而有利于L-苏氨酸产量的提高。

目录

声明

摘要

缩写表

1 前言

1．1 引言

1．2 L-苏氨酸的理化性质及应用

1．2．1 L-苏氨酸的理化性质

1．2．2 L-苏氨酸的应用

1．3 L-苏氨酸的生产方法及生产概况

1．3．1 L-苏氨酸的生产方法

1．3．2 L-苏氨酸生产概况

1．4 国内外直接发酵法生产L-苏氨酸的研究进展

1．5 大肠杆菌高密度发酵

1．5．1 乙酸合成机制

1．5．2 乙酸抑制菌体生长机制

1．5．3 控制乙酸生产策略

1．6 糖酵解途径的改造

1．6．1 磷酸果糖激酶

1．6．2 丙酮酸激酶

1．7 转运系统

1．7．1 葡萄糖转运系统

1．7．2 L-苏氨酸转运系统

1．8 立题背景及主要内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 主要仪器和试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要溶液

2．2．4 培养基

2．2．5 抗生素

2．3 实验方法

2．3．1 质粒的小剂量提取

2．3．2 DNA纯化回收

2．3．3 大肠杆菌基因组的提取

2．3．4 大肠杆菌化学转化法感受态的制备及转化实验

2．3．5 大肠杆菌电转化法感受态的制备及转化实验

2．3．6 PCR扩增

2．3．7 琼脂糖凝胶电泳

2．3．8 质粒的构建

2．3．9 利用Red同源重组基因敲除方法

2．3．10 胞内NADPH测定

2．3．11 胞内L-苏氨酸的测定

2．3．12 高效液相色谱法测定发酵液中的氨基酸含量

2．3．13 高效液相色谱法测定发酵液中的有机酸含量

2．3．14 大肠杆菌发酵L-苏氨酸的培养条件及分析测定方法

3 结果与讨论

3．1 大肠杆菌THRD糖酵解途径的改造

3．1．1 大肠杆菌THRDΔpykF和THRDΔpykA突变株的构建

3．1．2 大肠杆菌THRDΔpfkA和THRDΔpfkB突变株的构建

3．1．3 pyk和pfk的敲除对L-苏氨酸发酵的影响

3．1．4 pykF和pykA的敲除对E．coli THRD发酵L-苏氨酸的影响

3．1．5 pfkA和pfkB的敲除对E．coli THRD发酵L-苏氨酸的影响

3．1．6 pfkB和pyk双基因敲除对E．coli THRDD发酵L-苏氨酸的影响

3．1．7 pyk和pfk的敲除对NADPH生成的影响

3．1．8 糖酵解途径的改造对生产菌发酵L-苏氨酸影响的讨论

3．2 大肠杆菌TRFC糖转运系统的改造

3．2．1 大肠杆菌TRFCΔptsG突变株的构建

3．2．2 ptsG的敲除对L-苏氨酸发酵的影响

3．2．3 大肠杆菌TRFCΔptsG的5 L发酵罐发酵验证

3．2．4 ptsG的敲除对生产菌发酵L-苏氨酸产量影响的讨论

3．3 大肠杆菌TRFC L-苏氨酸转运系统的改造

3．3．1 大肠杆菌TRFCΔsstT突变株的构建

3．3．2 大肠杆菌TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的构建

3．3．3 sstT的敲除对E．coli TRFC发酵L-苏氨酸的影响

3．3．4 rhtC的过表达对E．coli TRFC发酵L-苏氨酸的影响

3．3．5 转运系统的改造对胞内外L-苏氨酸积累的影响

3．3．6 E．coli TRFCΔsstT+pSTV28-rhtC的5 L发酵罐发酵验证

3．3．7 转运系统改造对生产菌发酵L-苏氨酸产量影响的讨论

3．3．8 总结

4 结论

5 展望

参考文献

7 研究生期间所发表论文情况

致谢

附录