大肠杆菌L-丝氨酸吸收途径的改造及代谢分析

摘要

L-丝氨酸是一种在医药、食品、化妆品等领域具有广泛应用的非必需氨基酸。而微生物发酵法作为一种新兴的L-丝氨酸生产方法，具有生产成本低，生产效率高，环境污染小等优点，使其在未来具有十分广阔的应用前景。目前，L-丝氨酸生产菌株的构建手段及技术已经较为成熟，菌株构建主要通过两种方法实现：增强L-丝氨酸合成途径和弱化L-丝氨酸降解途径。随着合成途径及降解途径的改造日趋完善，人们的思路开始转向L-丝氨酸转运途径的改造上来。本文的研究方向则以转运途径中的吸收途径为主。基因 sstT、cycA、sdaC和tdcC是文献报道过的四个大肠杆菌 L-丝氨吸收基因，其中，sstT编码一种Na+耦合的丝氨酸-苏氨酸协同转运蛋白，cycA的转录产物是主要丙氨酸转运子，但是在大肠杆菌中，该转运子也参与丝氨酸和甘氨酸的吸收，sdcC和tdcC都能够编码H+耦合的协同转运蛋白，两者在整个编码区域具有很高的同源性，仅在3’端存在显著差异。其中sdaC编码一个高特异性的丝氨酸吸收蛋白，而tdcC则编码另一种丝氨酸-苏氨酸系统转运蛋白。
　　实验室前期在出发菌株SWCH-05（sdaA缺失、glyA突变）的基础上构建得到4株单基因缺陷菌和6株双基因缺陷菌，并对单基因缺陷菌的L-丝氨酸生产情况进行了研究。发酵结果表明L-丝氨酸吸收基因sdaC的敲除对菌株产L-丝氨酸能力的提升最大。
　　本研究则利用Red重组系统进一步构建了4株三基因缺陷菌及1株四基因缺陷菌，并综合之前的10株L-丝氨酸吸收基因缺陷菌通过测定菌株L-丝氨酸吸收活性对吸收基因不同敲除组合的影响进行了研究；针对该实验结果又进行了吸收基因过表达实验进一步证明吸收基因的功能；最后通过摇瓶发酵实验对菌株产L-丝氨酸能力进行了初步测定，主要研究及结果如下：
　　1）以双基因缺陷菌SWCH-61、SWCH-62和SWCH-64为基础，利用Red重组系统敲除L-丝氨酸吸收基因sdaC和tdcC进一步构建了4株三基因缺陷菌SWCH-71（△sstT，△cycA，△sdaC）、SWCH-72（△sstT，△cycA，△tdcC）、SWCH-73（△sstT，△sdaC，△tdcC）和SWCH-74（△cycA，△sdaC，△tdcC）以及1株四基因缺陷菌SWCH-08（△sstT，△cycA，△sdaC，△tdcC）。
　　2）为了解吸收基因敲除对菌株L-丝氨酸吸收能力的影响，我们对所有15株L-丝氨酸吸收基因缺陷菌的吸收活性进行了检测。结果表明，在单基因缺陷菌中，sdaC单基因缺陷菌SWCH-51的L-丝氨酸最终吸收活性是0.798 nmol(mg dry weight)?1，与出发菌SWCH-05相比下降23.34％。但是， sstT单基因缺陷菌SWCH-53、cycA单基因缺陷菌SWCH-52和tdcC单基因缺陷菌SWCH-54的最终吸收活性则分别提高了34.29%、78.29%和48.03%。而在双基因和三基因缺陷菌中，只有敲除了基因 sdaC的菌株其 L-丝氨酸吸收活性降低。但是当所有四个 L-丝氨酸吸收基因被敲除后， sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因缺陷菌SWCH-08的吸收活性接近于零。
　　3）针对吸收活性实验中部分菌株出现吸收活性上升的情况，我们利用双酶切系统构建了4个L-丝氨酸吸收基因重组质粒 pSC-sstT、pSC-cycA、pSC-sdaC和 pSC-tdcC，并将其分别导入出发菌SWCH-05中构建得到 L-丝氨酸吸收基因过表达菌株 SWCH-05/pSC-sstT、SWCH-05/pSC-cycA、SWCH-05/pSC-sdaC和SWCH-05/pSC-tdcC。通过测定它们的L-丝氨酸吸收活性发现基因sstT、cycA、sdaC和tdcC确实参与菌株的L-丝氨酸吸收，它们确实是L-丝氨酸吸收基因。其中，过表达基因cycA的菌株 SWCH-05/pSC-cycA L-丝氨酸吸收活性最强，达到2.983 nmol·(mg dry weight)-1， SWCH-05/pSC-sdaC次之。
　　4）11株多基因缺陷菌的摇瓶发酵结果表明， sstT·sdaC双基因敲除菌 SWCH-62/pSC-05， sstT·sdaC·tdcC、sstT·cycA·sdaC三基因敲除菌SWCH-73/pSC-05和SWCH-71/pSC-05的L-丝氨酸产量与对照菌 SWCH-05/pSC-05相比有明显提升，分别达到271.11、312.58和322.57 mg/L；而sstT·cycA·sdaC·tdcC四基因敲除菌SWCH-08/pSC-05的L-丝氨酸产量最高，达到了450.58 mg/L，是对照菌的6倍。在菌株生长方面，双基因敲除菌和三基因敲除菌的生长量优于对照菌或者与对照菌相近，而四基因敲除菌的生长量与对照菌相比则下降了28%。

目录

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缩略词表

第一章 引言

1.1 L-丝氨酸简介

1.2 L-丝氨酸应用及生产

1.3 微生物产L-丝氨酸的代谢途径

1.4 微生物产L-丝氨酸的研究背景及代谢工程改造

1.5 研究目的与意义

1.6 研究思路与内容

第二章 材料与方法

2.1 实验材料与仪器

2.2 实验方法

第三章 结果与讨论

3.1 L-丝氨酸吸收基因三缺陷及四缺陷菌的构建

3.2 吸收基因缺陷菌株的L-丝氨酸吸收活性实验

3.3 L-丝氨酸吸收基因重组质粒的构建

3.4 吸收基因过表达对菌株L-丝氨酸吸收活性的影响

3.5 L-丝氨酸吸收基因多基因缺陷菌的摇瓶发酵实验

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

致谢

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