Src蛋白激酶抑制剂对5-氟尿嘧啶诱导的结肠癌细胞凋亡的影响及意义

摘要

背景与目的：
　　据调查表明：结肠癌是世界第三常见的恶性肿瘤，其中一半以上发生在发达国家；近年来，发展中国家结肠癌的发病率也正逐步上升。在我国,结肠癌发病率和死亡率均较前有较大升高，其中发病率已居我国恶性肿瘤的第四位，死亡率居第五位,已严重危害我国人民的生命健康。目前，结肠癌的基本治疗方法是早期手术切除，中晚期患者在手术切除的基本上，术后辅以化疗的综合性治疗方案。然而，我国结肠癌患者发现时大多已处于中晚期，肿瘤细胞局部浸润和转移，已破坏了结肠有效的粘膜屏障功能及肿瘤范围不明显，单纯的手术治疗无法切除所有肿瘤，容易复发和转移。而在手术的基础上，术前术后行化疗治疗，不但可以降低肿瘤分期分级，为手术切除创造可行性，还降低了术后复发和转移的风险，对患者无病生存期的延长有着重要意义。但临床数据表明，对于该类患者手术切除癌肿后有很高的复发率，且对化疗有较高的耐药性，特别是5-氟尿嘧啶，许多患者最终因耐药而导致死亡。然而，5-氟尿嘧啶是结肠癌化疗中的基本药物。因此，减少患者对5-氟尿嘧啶耐药的发生，降低复发和转移，对中晚期结肠癌的预后治疗效果的提高有着重要意义，是当前结肠癌化疗研究的重要环节之一。
　　Src蛋白是由原癌基因 src编码，是位于细胞膜的非受体酪氨酸蛋白激酶（nrPTKs）家族中的一员，与肿瘤的发生发展有着密切关系。据报道，Src蛋白在多种肿瘤中呈现出高表达，而在结肠癌患者中高表达率为80％。因此，近年来 Src激酶抑制剂的研究已成为各种肿瘤治疗的热点。达沙替尼是一种二代Src激酶抑制剂，体外实验及动物实验研究发现其与奥沙利铂联用于结肠癌细胞具有协同作用。目前有多项一期及二期临床试验测试达沙替尼与紫杉醇，卡培他滨或奥沙利铂联用于乳腺癌，结肠癌等恶性肿瘤的治疗研究。Araujo，J.C.等人的一项最新三期临床研究结果表明：达沙替尼和紫杉醇联用于前列腺癌治疗，其疗效不改善转移性去势疗法抵抗的患者的生存期。但是，现在对于 src激酶抑制剂普遍的观点是：与传统的化疗药物联用能改善患者的治疗效果。然而，Carrato，A.等人做的另外一项类似的三期临床试验却得出了相反的结果：受体酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼联用FOLFIRI方案不改善转移性结肠癌患者的生存期，且联用导致更严重的安全问题。De Bouard，S.等人对于舒尼替尼的报道同样可在细胞水平抑制Src激酶的活性。因此，结肠癌患者术后及化疗过程中Src激酶抑制剂与传统化疗药物联用的疗效尚不确定，有待进一步研究。
　　研究表明：多种化疗耐药的发生与细胞凋亡的降低有关。本文基于此，通过细胞实验、MTS、Western blot等方法检测达沙替尼和5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞内Src蛋白的活性的影响；流式细胞仪、Western blot等方法研究5-氟尿嘧啶与达沙替尼联用对比氟尿嘧啶单用对结肠癌细胞凋亡的影响；来进一步研究src激酶抑制剂与传统化疗药物联用的疗效及其影响。
　　一、达沙替尼和5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞内Src蛋白表达活性的影响方法
　　1、MTS法检测达沙替尼、5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞存活率的影响。
　　2、Western blotting检测5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞内Src蛋白活性的影响。
　　3、Western blotting检测达沙替尼对结肠癌细胞内Src蛋白活性的影响。
　　4、Western blotting检测达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用对结肠癌细胞内 Src蛋白活性的影响。
　　结果：
　　1、达沙替尼、5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞均能抑制细胞的存活
　　MTS结果显示：SW480和HT29细胞用达沙替尼20nM处理48小时后，用酶标仪检测的结果得出，细胞的存活率为80%；SW480和HT29细胞用5-氟尿嘧啶50uM处理48小时后，用酶标仪检测的结果得出，细胞的存活率为50%（即SW480和HT29细胞用5-氟尿嘧啶处理的IC50的条件为50uM处理48小时）。
　　2、5-氟尿嘧啶增强结肠癌细胞内src蛋白的活性
　　Western blotting结果显示：用50uM浓度的5-氟尿嘧啶处理SW480和HT29细胞不同时间，代表src激酶活性的p-src的表达明显增加，且呈现出时间梯度依耐性。
　　3、达沙替尼抑制结肠癌细胞内src蛋白的活性
　　Western blotting结果显示：用达沙替尼作用于SW480和HT29细胞24小时，代表src激酶活性的p-src的表达明显降低，且呈现出浓度梯度依耐性；用20nM浓度的达沙替尼处理SW480和HT29细胞不同时间，代表src激酶活性的p-src的表达明显增加，且呈现出时间梯度依耐性。
　　4、达沙替尼与5-氟尿嘧啶诱导联用抑制结肠癌细胞内src的激活
　　Western blotting结果显示：达沙替尼与氟尿嘧啶联用降低结肠癌细胞p-src的表达。
　　二、达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用对结肠癌细胞的凋亡效率的影响方法
　　1、流式细胞学方法测达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用对结肠癌细胞凋亡的影响。
　　2、Western blotting检测达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用对结肠癌细胞内凋亡信号cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-7、PARP表达的影响。
　　结果：
　　1、达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用降低的结肠癌细胞的凋亡
　　流式细胞仪结果表明：用达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用（达沙替尼20nM、5-氟尿嘧啶50uM）作用于结肠癌细胞HT29细胞，HT29细胞早期的凋亡率为7.8%；单用5-氟尿嘧啶（50uM），HT29细胞早期凋亡率为14.3%；两组相比较：联用组比5-氟尿嘧啶单用组的凋亡率明显降低，具有统计学意义（p<0.05）。
　　2、达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用降低结肠癌细胞凋亡信号的表达
　　Western blotting结果显示：用达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用（达沙替尼20nM、5-氟尿嘧啶50uM）联用作用于结肠癌细胞SW480和HT29细胞48小时后，细胞内凋亡信号PARP、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-7的表达比单用5-氟尿嘧啶明显降低，结果提示达沙替尼与5-氟尿嘧啶联降低结肠癌细胞凋亡率。
　　三、结肠癌患者原发癌与复发转移癌组织标本中Src蛋白的表达方法
　　Envision法检测src蛋白在结肠癌组织中的表达
　　结果
　　结肠癌复发组织比原发结肠癌中src蛋白表达较低
　　免疫组化结果显示：经免疫组化染色发现同一患者原发癌的Src蛋白表达总体高于复发癌或转移癌。提示癌症复发可能来源于 Src低表达癌细胞对化疗不敏感。Src的存在亦可能在肿瘤化疗过程中起到积极作用。
　　结论：
　　1、5-氟尿嘧啶与达沙替尼联用降低src蛋白在结肠癌细胞中的表达；
　　2、达沙替尼与5-氟尿嘧啶联用降低结肠癌细胞的凋亡；
　　3、Src作为原癌基因，其表达的src蛋白，在结肠癌化疗过程中起到积极作用。

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中英文对照缩略词表

引言

第一章 达沙替尼和5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞内src蛋白活性的影响

1.1 主要仪器设备

1.2 主要材料和试剂

1.3 常用试剂配制

1.4 实验方法

1.5 结果

第二章 研究氟尿嘧啶联用达沙替尼对比氟尿嘧啶单用对结肠癌细胞凋亡的影响

2.1 主要仪器设备

2.2 主要材料和试剂

2.3 常用试剂配制

2.4 实验方法

2.5 结果

第三章 结肠癌患者原发癌与复发转移癌组织标本中Src的表达

3.1 材料与方法

3.2 标本采集和研究对象

3.3 研究方法

3.4 结果

讨论

全文结论

参考文献

综述:结肠癌多药耐药的研究进展

个人简历、在校发表论文

致谢