中国拟青霉(Paecilomyces sinensis)菌丝体糖肽的分离纯化及活性研究

摘要

冬虫夏草是我国的传统中药，中国拟青霉(Paecilomyces sinensis)是冬虫夏草中分离的一个无性型菌株，并且中国拟青霉在形态学、药理学及化学成分方面与天然冬虫夏草非常相似。本研究从中国拟青霉中分离出了具有生物活性的大分子均一糖肽，并对其结构、生物活性进行了研究。
　　本课题采用液体发酵法得到中国拟青霉菌丝体，干燥后的菌丝体通过水提醇沉法提取，分离除蛋白后得到分子量均一的糖肽粗品CPS-Ⅰ，其糖含量为71.3％。凯氏定氮法检测了CPS-Ⅰ蛋白质含量为19.1％。CPS-Ⅰ通过葡聚糖凝胶分离纯化之后得CPS-Ⅱ。通过高效液相色谱、核磁共振氢谱、炭谱、红外光谱等分析检测CPS-Ⅱ，检测结果表明CPS-Ⅱ为一种大分子糖肽。通过旋光仪测得其比旋光度+35°，表明不对称性比较低。应用高效液相色谱、气相色谱、红外光谱和核磁共振、高碘酸氧化和Smith降解、甲基化等方法测定CPS-Ⅱ一级结构，结果表明CPS-Ⅱ主要以1→3、1→4连接葡萄糖和半乳糖为主链，还有1→2，3，6连接葡萄糖，1→3，6连接甘露糖，1→6连接半乳糖。圆二色谱法分析糖肽构象得出:中国拟青霉菌丝体糖肽能与刚果红发生络合，是具有(+) cotton效应的α-螺旋结构，含有较多的螺旋、转角结构。
　　采用MTT法评价了CPS-Ⅱ细胞抗肿瘤活性，应用DPPH法和Fenton法检测了CPS-Ⅱ的抗氧化性。结果表明CPS-Ⅱ对HepG2细胞的半抑制浓度(IC50)为526μg/mL;CPS-Ⅱ清除DPPH·的能力为18.2％，CPS-Ⅱ浓度为0.1mg/mL时羟基自由基清除率为17.2％。
　　本文首次从中国拟青霉菌丝体中分离出糖肽，并进行了结构表征和生物活性评价。丰富了虫草生物活性物质的研究内容。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 冬虫夏草研究进展

1．2 糖肽的研究概述

1．2．1 糖肽的研究简述

1．2．2 几种常见糖肽

1．3 糖肽的提取方法

1．3．1 发酵法

1．3．2 酶转化法

1．3．3 直接提取法

1．3．4 化学合成法

1．4 糖肽的分离纯化

1．5 糖肽的纯化及纯度鉴定

1．6 糖肽的分子量测定

1．7 糖基部分结构表征

1．7．1 化学水解法

1．7．2 高碘酸氧化和Smith降解

1．7．3 甲基化分析

1．7．4 红外光谱分析

1．7．5 紫外光谱分析

1．7．6 气相色谱分析

1．7．7 高效液相色谱分析

1．7．8 质谱分析

1．7．9 圆二色谱分析

1．7．10 核磁共振分析

1．7．11 比旋光度分析

1．7．12 刚果红实验

1．7．13 β-消去反应

1．8 活性分析

1．8．1 体外抗肿瘤活性

1．8．2 抗氧化活性

1．9 研究目的、意义和内容

1．9．1 目的和意义

1．9．2 内容

2 材料与方法

2．1 实验材料、仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．1．4 主要溶液

2．2 实验方法

2．2．1 中国拟青霉菌丝体的培养

2．2．3 中国拟青霉菌丝体糖肽的纯化

2．2．4 糖含量的测定

2．2．5 蛋白质含量的测定

2．2．6 糖肽纯度及相对分子质量的测定

2．2．7 分子量分布的测定

2．2．8 比旋光度的测定

2．2．9 紫外光谱分析

2．2．10 单糖组成分析

2．2．11 红外光谱的分析

2．2．12 高碘酸氧化和Smith降解

2．2．13 CPS-Ⅱ甲基化分析

2．2．14 核磁共振分析

2．2．15 刚果红实验

2．2．16 圆二色谱分析

2．2．17 β-消去反应

2．2．18 MTT法

2．2．19 清除DPPH·活性研究

2．2．20 清除OH·活性研究

3．结果与讨论

3．1 中国拟青霉菌丝体的培养

3．2 中国拟青霉菌丝体糖肽提取和纯化

3．2．1 中国拟青霉菌丝体糖肽提取

3．2．2 中国拟青霉菌丝体糖肽的纯化

3．2．3 糖含量测定

3．2．4 糖肽中氮含量的测定

3．2．5 HPLC法测定纯度

3．3 CPS-Ⅱ糖基结构分析

3．3．1 糖肽的紫外光谱分析

3．3．2 CPS-Ⅱ比旋光度

3．3．3 CPS-Ⅱ单糖组成分析

3．3．4 CPS-Ⅱ红外光谱分析

3．3．5 CPS-Ⅱ连接方式分析

3．4 高级结构分析

3．4．1 CPS-Ⅱ的核磁共振图谱分析

3．4．2 刚果红实验

3．4．3 糖肽的圆二色谱分析

3．4．4 糖肽键的鉴定

3．5 中国拟青霉菌丝体糖肽的生物活性

3．5．1 体外抗肿瘤活性

3．5．2 糖肽的抗氧化活性

4．结论

5．展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢