基于“中药-网络-效应”整合的益心舒胶囊作用解析及策略拓展应用

摘要

研究背景：
　　中药方剂是指在中医药理论指导下由不同中药配伍而成的方药。中药方剂由于其临床疗效好、毒副作用小等特点而被广泛应用，成为中医临床应用的主要的治疗形式和手段。但是由于中药方剂所含成分复杂，制约了对其作用机制的深入研究，影响了其在临床上的精准应用。针对中药方剂品种临床定位模糊和作用机制不清的问题，本课题通过对代表性中药方剂益心舒胶囊(YXS)的研究，提出了“中药-网络-效应”的整合模式，解析成分群与分子网络关联性，系统分析了YXS的作用机制及临床应用特点，并将这一模式拓展到中药方剂小儿扶脾颗粒(XEFP)研究。
　　本课题以益心舒胶囊(YXS)为例，提出并验证“中药-网络-效应”的研究策略可行性。YXS是基于《内外伤辨惑论》名方“生脉散”研制开发的复方制剂，是中成药的代表药物之一。YXS主要由人参、麦冬、五味子、黄芪、丹参、川芎、山楂等七味中药材组成。YXS在临床上已有被应用于慢性心功能衰竭（heart failure，HF，心衰）、心脏神经官能症和冠心病心绞痛等心血管疾病。然而，大多研究多限于YXS治疗心衰等临床观察的研究，尚未对YXS干预心衰的分子作用机制开展研究。这制约了YXS在临床上的定位和精准应用。因此，开展YXS干预心衰的作用解析研究具有必要性。
　　另外，本课题将“中药-网络-效应”的研究模式拓展应用到小儿扶脾颗粒(XEFP)的研究。XEFP是基于《太平惠民合剂局方》名方“参苓白术散”裁减而研制的中药方剂品种，是中成药的代表药物之一。XEFP主要由白术、陈皮、党参、茯苓、莲子、山楂等六味药组成，具有健脾胃，助消化功效，临床常用于治疗小儿脾胃气虚，消化不良。然而，大多研究多限于XEFP干预小儿厌食症临床观察的研究，尚未对XEFP干预功能性消化不良的分子作用机制开展研究。因此，本课题将“中药-网络-效应”的研究模式拓展应用到XEFP作用解析研究具有必要性。
　　因此，针对YXS和XEFP的临床定位模糊和作用机制不清的问题，本课题提出了“中药-网络-效应”整合策略，即通过中药方剂各化学成分的网络药理学分析，结合蛋白质组学等技术，构建中药与生物效应的网络联系，选择合适的药理模型，揭示中药成分与靶标之间的相互作用关系及各个节点的生物学意义，阐明其的复杂作用机制，期以指导临床定位。
　　研究内容：
　　第一部分 基于“中药-网络-效应”整合的益心舒胶囊干预心衰作用解析研究
　　首先基于网络药理学策略，分析了YXS的化学成分、分子靶标和疾病网络，并通过体内、体外心衰模型，考察了YXS干预心衰的药理作用。在此基础上，通过对心衰大鼠海马组织的检测，考察了YXS对心衰导致大脑海马组织功能异常的干预作用效果。
　　1.基于BATMAN-TCM数据库，提取了YXS相关的334个化学成分与相应的1874个分子靶标。结合DAVID数据库和STRING数据库的分析，得到YXS化学成分、分子靶标和疾病的网络关系，富集结果发现YXS可能与动脉粥样硬化、心衰、抑郁症和焦虑症等疾病相关。通过中医理论、YXS临床经验和生物信息学分析三个维度，本课题重点考察YXS干预心衰疾病的药效及其作用机制。
　　2.通过冠状动脉左前降支结扎的方法建立大鼠心衰模型，检测超声心动图和生化指标，发现YXS连续干预6周后，能明显减少心衰大鼠心室腔增大，增加左心室射血分数，明显减少脑钠肽(BNP)和N-端脑钠肽前体(NT-pro BNP)水平;并通过内皮素-1(endothelin-1，ET-1)诱导的人源心肌细胞（人源多能干细胞诱导分化心肌细胞，hiPS-CMs）心衰模型，检测人源心肌细胞BNP表达水平，发现YXS能改善BNP表达水平。以上结果表明YXS能够改善心衰大鼠的心功能。
　　3.采用了蛋白质组学技术方法，定量比较了ET-1诱导的人源心肌细胞模型在不同干预条件下的蛋白质组特征，并富集生物学信号通路和关键作用蛋白，筛选出YXS干预心衰作用的潜在分子标志物为:利钠肽A(natriuretic peptide precursor A，NPPA)、心肌肌钙蛋白-3(troponin I type3，cardiac，TNNI3)、半乳糖素-3(galectin-3，GAL-3)、热休克蛋白-70(heat shock protein70，HSP70)、心型脂肪酸结合蛋白-3(muscle and heart-type fatty acid-binding protein3，FABP3)、ATP-柠檬酸合成酶(ATP-citrate synthase，ACLY)、细胞骨架相关蛋白-5(Cytoskeleton-associatedprotein5，CKAP5)。并通过ELISA方法，验证其在体内和体外心衰模型过程中的变化情况。结合网络药理学分析，构建YXS作用的分子靶标网络与其相应效应分子的关系图，提示YXS可能通过分子网络(BNP、TNNI3、GAL-3、FABP3和CKAP5)发挥干预心衰的作用。
　　4.基于网络药理学分析结果，利用依文思蓝检测海马组织血脑屏障通透性，并用Western Blot方法检测与血脑屏障通透性相关的蛋白ZO-1和AQP4表达情况，发现YXS能改善心衰导致海马血脑屏障异常;通过ELISA方法检测海马组织的炎性因子IL-1beta、TNF-α和IL-6表达水平，发现YXS能改善心衰导致海马炎性因子的表达。利用网络药理学进一步分析YXS化学成分与分子靶标，富集得到过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)信号通路，并利用Western Blot方法，验证了YXS可能通过干预PPARγ信号通路，减少海马组织炎性反应的机制，从而发挥改善心衰导致海马功能异常的作用。
　　第二部分 基于“中药-网络-效应”整合的小儿扶脾颗粒干预功能性消化不良研究
　　基于建立的“中药网络-效应”整合模式，本课题将这一整合策略拓展应用到小儿扶脾颗粒(XEFP)的研究。
　　1.基于BATMAN-TCM数据库，提取了XEFP相关的113个化学成分与相应的456个分子靶标。结合DAVID数据库和STRING数据库的分析，得到XEFP化学成分、分子靶标和疾病的网络关系，富集结果发现XEFP可能与功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）等疾病相关。通过中医理论、XEFP临床经验和生物信息学分析三个维度，本课题重点考察XEFP干预功能性消化不良的药效及其作用机制。
　　2.利用碘乙胺和隔夜禁食方法构建功能性消化不良大鼠模型，并进行药物干预3周，通过检测各组胃排空功能、血清中唾液淀粉酶、胃泌素和一氧化氮合成酶含量等指标，结果表明XEFP能够明显改善FD的症状。
　　3.在药效研究基础上，开展胃组织蛋白质组研究，共鉴定到4045个蛋白。利用网络药理学分析XEFP化学成分与分子靶标，富集到HTR3A和c-FOS两个关键靶标。结合Western Blot验证，发现XEFP可能通过调控HTR3A和c-FOS而发挥干预功能性消化不良作用。
　　第三部分 丹红注射液抗缺血性脑卒中关键转录因子靶标筛选及其作用研究
　　本人于博士期间也开展了一部分其他的研究工作。本课题组基于“中药-网络-效应”整合策略，前期研究已获得了丹红注射液(DHI)抗缺血性脑卒中药效研究和蛋白质组数据，本研究目的是通过分子生物学实验，初步筛选DHI干预缺血性脑卒中的关键转录因子。
　　1.利用Western Blot和EMSA实验，筛选出了DHI抗缺血性脑卒中的关键转录因子SATB1和POU3F1。结合文献信息，本研究重点研究转录因子SATB1。
　　2.通过生物信息学预测，提示SATB1可能存在相互作用的靶标有Bcl-2和IL-4;通过实时荧光PCR检测Bcl-2和IL-4，结果提示SATB1在缺血性脑卒中可能调控Bcl-2和IL-4发挥抗缺血性脑卒中的作用。
　　综上所述，本课题通过对代表性中药方剂益心舒胶囊(YXS)和小儿扶脾颗粒(XEFP)的研究，基于“中药-网络-效应”的整合模式，解析成分群与分子网络关联，系统分析了其作用机制及临床应用特点。
　　本研究创新点:
　　1.基于“中药-网络-效应”整合的研究模式，通过对YXS干预心衰作用机制的研究，揭示了YXS可能通过分子靶标网络（BNP、TNNI3、GAL-3、FABP3和CKAP5）干预心衰。
　　2.发现YXS能改善心衰导致海马组织异常的作用，并揭示了其可能通过对PPARγ信号通路的作用而发挥疗效。
　　3.明确了XEFP干预功能性消化不良的作用，并发现XEFP可能通过HTR3A和c-FOS靶标发挥干预功能性消化不良作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

文献综述

综述一中药方剂复杂体系解析的现代研究方法综述

综述二慢性心功能衰竭的研究进展

综述三功能性消化不良研究进展

前言

技术路线

第一部分基于“中药-网络-效应”整合的益心舒胶囊干预心衰的作用解析研究

第一章益心舒胶囊作用靶标和疾病的生物信息学分析

1材料与方法

2数据分析

3结果

4讨论

第二章益心舒胶囊干预心衰的药效研究

第一节益心舒胶囊干预大鼠心衰模型的药效研究

第二节益心舒胶囊干预人源心肌细胞心衰模型的药效研究

第三章益心舒胶囊干预心衰关键靶标筛选与验证

第一节益心舒胶囊干预心衰的关键靶标筛选

第二节益心舒胶囊干预心衰关键靶标验证

第四章益心舒胶囊干预心衰导致海马组织功能异常的药效研究及作用机制研究

1实验材料

2方法

3结果

4讨论

小结

第二部分基于“中药-网络-效应’’整合的小儿扶脾颗粒干预功能性消化不良研究

第一章小儿扶脾颗粒作用靶标和疾病的生物信息学分析

1材料与方法

2数据分析

3结果

4讨论

第二章小儿扶脾颗粒干预功能性消化不良的药效研究

1实验材料

2方法

3结果

4讨论

第三章小儿扶脾颗粒干预功能性消化不良关键靶标筛选及验证

1实验材料

2方法

3结果

4讨论

小结

第三部分丹红注射液抗缺血性脑卒中关键转录因子靶标筛选及作用研究

1实验材料

2方法

3结果

4讨论

第二章关键转录因子SATB1在缺血性脑卒中的作用研究

1实验材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

总结与展望

致谢

个人简历