巴氏醋杆菌核酸修复酶UvrA对菌体耐受性的影响

摘要

醋酸是一种常见的弱酸，广泛应用于医药和食品行业。醋酸菌具有转化乙醇生产醋酸的能力，并且能够耐受高浓度醋酸，常用于醋酸的发酵生产。微生物中核酸修复酶UvrA与菌体对酸、热等不良环境的耐受性相关，本论文克隆巴氏醋杆菌AC2005中的核酸修复酶基因uvrA，研究其对大肠杆菌醋酸、低pH、热和过氧化耐受性的影响，同时分析了巴氏醋杆菌AC2005核酸修复酶uvrA基因敲除对菌体耐受性的影响。本论文从核酸修复的角度对醋酸菌特殊的醋酸耐受机制进行研究，具有重要的应用价值和科学意义。
　　分别比较了醋酸、醋酸根和相同pH的HCl对巴氏醋杆菌AC2005在发酵初期生长菌体浓度倍增时间的影响，发现醋酸对菌体的生长有明显的抑制作用。与对照相比，1％醋酸浓度条件下发酵初期菌体浓度倍增时间增加了5.7倍。醋酸对菌体的抑制主要是醋酸分子造成的，而不是由H+或AC-单独造成的。利用脉冲场凝胶电泳分析不同醋酸浓度处理条件下菌体基因组断裂情况，发现经醋酸处理后巴氏醋杆菌基因组有明显的断裂。利用荧光定量PCR(RT-PCR)的方法比较了不同醋酸浓度条件下巴氏醋杆菌核酸修复酶UvrA基因的转录水平，发现与对照相比1％和2％醋酸浓度条件下，uvrA相对转录水平分别提高了65％和97％，说明UvrA可能与巴氏醋杆菌的醋酸耐受性相关。
　　克隆巴氏醋杆菌AC2005中的核酸修复酶基因uvrA，构建重组表达质粒pMV24-uvrA，并在大肠杆菌JM109中重组表达，研究其对大肠杆菌醋酸、低pH、热和过氧化等压力耐受性的影响。发现分别在0.5％醋酸、pH4、53℃、0.15％H2O2四种压力条件下处理40 min后，重组菌E.coli JM109/pMV24-uvrA的存活率分别是对照菌E.coli JM109/pMV24的11.2、4.7、19.2和7.5倍，说明来源于巴氏醋杆菌的核酸修复酶UvrA能够提高大肠杆菌对醋酸、低pH、热与过氧化的耐受性。
　　同时研究了巴氏醋杆菌AC2005核酸修复酶uvrA基因敲除对菌体耐受性影响。分别在2％醋酸、pH3、53℃、0.15％H2O2四种压力条件下处理40 min后，野生菌A.pasteurianus AC2005的存活率分别是敲除菌A.pasteurianusA C2005-ΔuvrA的105.8、4.1、4.6和96.5倍，说明核酸修复酶UvrA基因的缺失会明显降低巴氏醋杆菌对醋酸、低pH、热和过氧化的耐受性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 醋酸概述

1．1．1 醋酸的理化性质

1．1．2 醋酸的应用

1．2 醋酸菌简介

1．2．1 醋酸菌分类

1．2．2 醋酸菌的发酵机制

1．2．3 醋酸发酵的研究现状

1．3 醋酸菌的醋酸耐受性

1．3．1 醋酸对菌体的影响

1．3．2 醋酸菌的醋酸耐受机制

1．4 DNA损伤修复机制

1．4．1 DNA损伤修复机制简介

1．4．2 DNA损伤修复机制类型

1．5 核酸修复酶UvrA

1．5．1 UvrABC型蛋白

1．5．2 UvrA简介

1．5．3 UvrA蛋白与耐性间的关系

1．6 立题背景与研究意义

1．7 主要研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 质粒

2．2 主要仪器和试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 培养基

2．2．4 主要溶液

2．3 实验方法

2．3．1 巴氏醋杆菌的培养

2．3．2 大肠杆菌的培养

2．3．3 质粒的小量提取

2．3．4 大肠杆菌化学转化感受态的制备及转化

2．3．5 重组质粒的构建

2．3．6 SDS-PAGE凝胶电泳

2．3．7 醋酸浓度对菌体生长的影响

2．3．8 醋酸组分对菌体生长的影响

2．3．9 巴氏醋杆菌基因组脉冲场凝胶电泳

2．3．10 巴氏醋杆菌uvrA基因荧光定量分析

2．3．11 重组表达UvrA对大肠杆菌耐受性的影响

2．3．12 巴氏醋杆菌uvrA基因敲除对菌体耐受性的影响

2．4 分析方法

2．4．1 pH的测定

2．4．2 菌体生物量的测定

2．4．3 菌体初始浓度倍增时间

2．4．4 DNA断裂量

2．4．5 菌体存活率计算

2．4．6 生物信息学分析方法

3 结果与讨论

3．1 醋酸对巴氏醋杆菌AC2005生长的抑制作用

3．1．1 醋酸浓度对菌体生长的影响

3．1．2 醋酸组分对菌体生长的影响

3．2 脉冲场凝胶电泳检测醋酸诱发DNA损伤

3．3 醋酸对巴氏醋杆菌uvrA基因转录水平的影响

3．4 巴氏醋杆菌AC2005核酸修复酶UvrA基因的克隆及序列分析

3．4．1 巴氏醋杆菌AC2005 uvrA基因的克隆

3．4．2 巴氏醋杆菌AC2005 uvrA基因的序列分析

3．5 重组质粒的构建和蛋白表达

3．5．1 重组质粒的构建

3．5．2 重组蛋白的表达

3．6 巴氏醋杆菌核酸修复酶UvrA重组表达对大肠杆菌耐受性的影响

3．6．1 UvrA重组表达对大肠杆菌醋酸耐受性的影响

3．6．2 UvrA重组表达对大肠杆菌低pH耐受性的影响

3．6．3 UvrA重组表达对大肠杆菌热耐受性的影响

3．6．4 UvrA重组表达对大肠杆菌过氧化耐受性的影响

3．7 巴氏醋杆菌uvrA基因敲除对菌体耐受性的影响

3．7．1 uvrA基因敲除对巴氏醋杆菌醋酸耐受性的影响

3．7．2 uvrA基因敲除对巴氏醋杆菌低pH耐受性的影响

3．7．3 uvrA基因敲除对巴氏醋杆菌热耐受性的影响

3．7．4 uvrA基因敲除对巴氏醋杆菌过氧化耐受性的影响

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢