粘康酸细胞工厂的构建与优化

摘要

粘康酸（cis，cis-muconic acid，MA）是具有成对的共轭双键的不饱和二元羧酸，在260 nm处具有很好的紫外吸收性质，不仅可用于紫外防护剂和兵工特种用品如隐形飞机涂层，而且也是制备功能树脂、医药及农用化学品潜在原材料，主要用于合成大宗化学品己二酸。目前，生物法合成粘康酸备受关注，但是都存在不少问题影响将来的产业应用。在宿主选择方面:克雷伯氏肺炎菌是致病菌，遗传操作危险、遗传背景不够清晰;酿酒酵母遗传操作较难、粘康酸产量过低，不利于作为合成粘康酸的出发菌株。在原料方面:以苯甲酸、儿茶酚等作为合成粘康酸的原料，因其具有毒性且操作不安全，不利于粘康酸的大规模生产。在发酵方面，很多生物合成粘康酸均是在阻断莽草酸代谢途径的宿主菌中引入含有粘康酸合成途径的质粒实现的，但在宿主菌中质粒表达不稳定，同时发酵过程中需要添加许多的营养物质来维持宿主菌的生长与生产，大大的增加了粘康酸生产成本。
　　针对以上问题，本论文选取以来源广泛的可再生资源葡萄糖作为原料，遗传背景简单、操作容易且研究报道比较深入的大肠杆菌作为出发菌株，采用理性设计原则，利用两步同源重组在生产三脱氢莽草酸底盘细胞WJ060的基因组上，先后整合不同强度组成型启动子组合调控用于合成粘康酸的3个外源基因（aroZ，aroY，catA），依次成功构建了3个原儿茶酸细胞工厂（前体物细胞工厂），9个儿茶酚细胞工厂（前体物细胞工厂）以及27个粘康酸细胞工厂，其中粘康酸细胞工厂MA30摇瓶发酵粘康酸产量最高达到1.7 g/L。在5L发酵罐分批补料发酵中，MA30经过78h发酵，粘康酸产量达到10.3 g/L，提高了将近5倍，从而实现了在简单的无机盐发酵培养基中能安全、稳定地合成粘康酸，为降低粘康酸的生产成本，实现粘康酸大规模生产提供了可能。
　　随后，为了进一步提高粘康酸工程菌的生产能力，采用非理性设计原则，针对粘康酸在260 nm处有很好的紫外吸收的性质首次成功构建了粘康酸的高通量筛选方法，并利用对宿主菌没有伤害的进化工程新技术（基于dnaQ突变体的基因组复制工程）构建工程菌突变体文库，经过两轮的筛选，成功筛选到了粘康酸产量得到提高了8％的大肠杆菌MA30-G2。在5L发酵罐分批补料发酵中，MA30-G2经过72 h的发酵，粘康酸产量达到最大为11.5 g/L，与MA30发酵相比提高了11.6％，成功利用非理性设计原则提高了粘康酸细胞工厂的产能。同时对筛选得到的进化菌株与出发菌株进行基因组重测序分析，发现了7个可能影响粘康酸合成的基因，初步揭示了细胞工厂性能变化的分子机制，为后续的反向代谢工程研究提供了基础。
　　本研究利用理性设计和非理性设计相结合，有效地构建和优化了粘康酸细胞工厂，不仅为生物合成粘康酸奠定了基础，也为其他生物基产品的生物合成提供了参考。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 粘康酸

1．1．1 粘康酸的结构、性质以及应用

1．1．2 粘康酸制造概述

1．2 进化工程

1．3 本课题研究内容、目的及意义

1．3．1 研究目的及意义

1．3．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 引物序列

2．1．3 主要药品及试剂

2．1．4 主要设备

2．2 实验方法

2．2．1 粘康酸细胞工厂的构建

2．2．2 粘康酸细胞工厂的优化

2．2．3 HPLC分析三脱氢莽草酸、原儿茶酸、儿茶酚以及粘康酸含量

2．2．4 粘康酸工程菌摇瓶发酵与分批补料发酵

3 结果与讨论

3．1 原儿茶酸代谢途径的构建、组合调控及发酵

3．1．1 原儿茶酸代谢途径的构建与组合调控

3．1．2 原儿茶酸工程菌摇瓶发酵评价

3．2 儿茶酚代谢途径的构建、组合调控及发酵

3．2．1 儿茶酚代谢途径的构建与组合调控

3．2．2 儿茶酚工程菌摇瓶发酵评价

3．3 粘康酸代谢途径的构建、组合调控及发酵

3．3．1 粘康酸代谢途径的构建与组合调控

3．3．2 粘康酸工程菌摇瓶发酵评价

3．3．3 MA30摇瓶发酵优化

3．3．4 MA30的5 L发酵罐分批补料发酵评价

3．4 粘康酸细胞工厂的优化

3．4．1 粘康酸高通量筛选方法的建立

3．4．2 文库的构建与筛选

3．4．3 筛选得到的进化菌株摇瓶发酵评价

3．4．4 MA30-G2的5 L发酵罐分批补料发酵评价

3．5 基因组重测序分析

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢

附录