l-苏氨酸生产菌的构建及发酵优化

摘要

L-苏氨酸是人体必需氨基酸之一，在食品、医药、饲料等领域有广泛应用。在大肠杆菌发酵过程中，草酰乙酸作为前体物参与L-苏氨酸的合成，增加前体物草酰乙酸的合成量，对于提高L-苏氨酸产量有一定的帮助。此外，增加细胞内NADPH的合成量，为L-苏氨酸合成提供足够的还原力，也是提高L-苏氨酸产量的重要策略。优化培养条件，在培养基中添加甜菜碱，对提高L-苏氨酸的转化率有积极作用。
　　在L-苏氨酸发酵生产过程中，乙醛酸循环起到部分回补途径的功能。本实验利用Red重组技术，以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株，构建了iclR基因缺失菌株THRD△iclR以及不同强度启动子替换aceBAK启动子的菌株THRD P1和THRD P2。摇瓶发酵结果显示，THRD△iclR的L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为42.60±1.23 g/L和32.77％，较原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17％)分别提高20.61％和20.70％。THRD P1 L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为36.50±1.42 g/L和28.08％，较原菌THRD（35.32±1.07 g/L和27.17％）分别提高3.34％和3.39％。而THRD P2发酵8h后菌体生长停滞，最终L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为8.31±1.31 g/L和20.78％，较原菌THRD（35.32±1.07 g/L和27.17％）分别降低了76.47％和23.52％。综上所述，适当增强乙醛酸循环有利于L-苏氨酸的积累，而过强的乙醛酸循环会影响菌体的正常代谢。
　　丙酮酸羧化酶是供给草酰乙酸的主要补充反应，但大肠杆菌中不含此酶。以L-苏氨酸生产菌E.coli THRD为出发菌株，在大肠杆菌中异源表达来自枯草芽孢杆菌中的丙酮酸羧化酶基因pycA，摇瓶结果显示，E.coli THRD+pWSK29-pycA的L-苏氨酸产量及糖酸转化率分别为46.09±1.58 g/L和30.72％，较E.coli THRD+pWSK29(41.05±2.51 g/L和27.37％)分别提高12.28％和12.24％;E.coli THRD+pTrc99a-pycA与E.coli THRD+pTrc99a相比，生物量提高了31.69％，而L-苏氨酸的产量及糖酸转化率分别为35.91±1.15 g/L和23.94％，较E.coli THRD+pTrc99a(40.06±1.25 g/L和26.71％)分别降低了10.36％和10.37％，表明适当表达丙酮酸羧化酶有利于L-苏氨酸的合成。随后构建了基因整合菌E.coli THRD pykF∷pycA，发酵结束后，THRDpykF∷pycA的L-苏氨酸产量与E.coli THRD△pykF相比变化并不明显，表明在敲除丙酮酸激酶基因(pykF)的基础上再异源表达pycA基因，对于L-苏氨酸的积累影响不大。
　　NADPH是细胞内重要的还原力，通过提高NADPH的供应，增强L-苏氨酸的代谢支路，能促进苏氨酸的合成，提高产率。本实验以L-苏氨酸生产菌E.coli THRD为出发菌株，用来自丙酮丁醇梭杆菌中的NADP+依赖性3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gapC替换在糖酵解途径中起重要作用的NAD+依赖性3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因gapA，实验证明，gapA替换成功后，胞内NADPH的合成量得到提高，摇瓶发酵结果显示，THRD gapA∷gapC L-苏氨酸产量较原菌THRD略有提高;利用5L发酵罐进行分批补料发酵实验，结果表明，改造菌THRD gapA∷gapC L-苏氨酸产量119.53 g/L，糖酸转化率49.51％，较原菌(109.98 g/L，45.56％)分别提高了8.68％和8.67％。综上所述，替换糖酵解途径关键酶基因gapA，胞内NADPH量增加，有利于大肠杆菌THRD高产L-苏氨酸。
　　甜菜碱作为一种生物碱，可以调节胞内渗透压，提供甲基。本实验以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株，在培养基中分别添加甜菜碱盐酸盐与磷酸盐，发酵结果表明，底料中先添加0.5 gL甜菜碱盐酸盐，再按1g/L随糖流加的组合效果最为明显，转化率为54.94％，较原菌THRD(47.75％)提高了15.06％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 引言

1．2 L-苏氨酸的理化性质及应用

1．2．1 L-苏氨酸的理化性质

1．2．2 L-苏氨酸的应用

1．3 L-苏氨酸的生产方法及生产概况

1．3．1 L-苏氨酸的生产方法

1．3．2 L-苏氨酸生产概况

1．4 国内外直接发酵法生产L-苏氨酸的研究进展

1．5 乙醛酸途径的改造

1．6 丙酮酸代谢途径的改造

1．7 NADPH的合成

1．7．1 磷酸戊糖途径合成NADPH

1．7．2 TCA途径合成NADPH

1．7．3 NAD激酶合成NADPH

1．7．4 转氢酶系统合成NADPH

1．7．5 NADPH合成的其他方式

1．8 代谢流量分析概述

1．8．1 13C代谢流分析

1．8．2 代谢平衡法

1．9 L-苏氨酸的发酵优化

1．10 立题背景及主要内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 主要仪器和试剂

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 主要溶液

2．2．4 抗生素

2．2．5 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 质粒的小剂量提取

2．3．2 DNA纯化回收

2．3．3 大肠杆菌基因组的提取

2．3．4 大肠杆菌化学转化法感受态的制备及转化实验

2．3．5 大肠杆菌电转化法感受态的制备及转化实验

2．3．6 PCR扩增

2．3．7 琼脂糖凝胶电泳

2．3．8 质粒的构建

2．3．9 Red同源重组基因敲除方法

2．3．10 重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳

2．3．11总RNA的提取和实时荧光定量PCR

2．3．12 胞内NADPH测定

2．3．13 3-磷酸甘油醛脱氢酶活力的测定

2．3．14 代谢流量分析

2．3．15 高效液相色谱法测定发酵液中的氨基酸含量

2．3．16 高效液相色谱法测定发酵液中的有机酸含量

2．3．17 大肠杆菌发酵L-苏氨酸的培养条件及分析测定方法

3 结果与讨论

3．1 大肠杆菌THRD乙醛酸途径的改造

3．1．1 大肠杆菌THRD△iclR突变株的构建

3．1．2 aceBAK启动子的替换及鉴定

3．1．3 实时定量PCR分析

3．1．4 iclR的敲除及aceBAK启动子的替换对L-苏氨酸发酵的影响

3．1．5 乙醛酸途径的改造对L-苏氨酸产量影响的讨论

3．2 大肠杆菌THRD丙酮酸代谢途径的改造

3．2．1 外源丙酮酸羧化酶基因的克隆与筛选

3．2．2 外源丙酮酸羧化酶基因的诱导表达及SDS-PAGE分析

3．2．3 大肠杆菌THRD+pWSK29-SpycA的构建

3．2．4 大肠杆菌THRD pykF∷pycA突变株的构建

3．2．5 外源丙酮酸羧化酶基因的表达对L-苏氨酸发酵的影响

3．2．6 丙酮酸代谢途径的改造对L-苏氨酸产量影响的讨论

3．3 大肠杆菌THRD胞内NADPH再生

3．3．1 大肠杆菌THRD gapA∷gapC突变株的构建

3．3．2 gapC替换gapA对L-苏氨酸发酵的影响

3．3．3 gapC替换gapA对E．coli THRD发酵L-苏氨酸的影响

3．3．4 gapA替换对NADPH生成的影响

3．3．5 发酵过程中GAPDH酶活力的变化

3．3．6 苏氨酸合成代谢流量分析

3．3．7 总结

3．4 大肠杆菌THRD发酵L-苏氨酸条件优化

3．4．1 培养基中添加甜菜碱对L-苏氨酸发酵的影响

3．4．2 苏氨酸合成代谢流量分析

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读研究生期间论文发表情况

致谢