牛奶子果实EutPSY和LCY-e基因的功能研究及EutUGP基因的克隆

摘要

番茄红素作为一种天然色素，是迄今为止自然界中发现的最强的抗氧化剂之一，在人类健康上有着重要功效。它具有抗氧化、抑制突变、降低核酸损伤，调节细胞代谢及胆固醇代谢，减少心血管疾病及预防癌症等多种保健功能。鉴于当下社会对健康饮食的追求，人们对番茄红素的消费需求越来越大。
　　 牛奶子（Elaeagnus umbellate Thunb.）是一种胡颓子科胡颓子属植物，其成熟果实中番茄红素含量相当于普通番茄的18倍，而且牛奶子中富含糖类、有机酸、维生素等营养物质，风味独特。因此研究牛奶子果实成熟过程中番茄红素积累机制及糖类、酸类营养物质代谢机理，对挖掘番茄红素新种质资源，选育高产番茄红素的番茄新品种或其他经济作物，扩大番茄红素来源具有十分重要的意义。本实验室前期研究显示，在牛奶子果实成熟过程中不但EutPSY（八氢番茄红素合成酶）等关键基因上调，而且EutLCY-e（番茄红素ε-环化酶）基因出现绝对沉默，即果实完全成熟时表达为零，因此EutLCY-e基因可能和EutPSY基因一样对番茄红素的高积累起着重要作用。蛋白组学研究显示，牛奶子EutUGP（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）等4个蛋白受果实成熟诱导，推测可能直接或者间接与牛奶子果实可溶性糖积累有关。本论文主要研究内容及结果如下:
　　 1.克隆获得牛奶子EutPSY基因全长和番茄SILCY-e基因片段，构建番茄果实E8启动子引导的EutPSY基因超表达载体和番茄SILCY-e基因沉默载体，对番茄中蔬四号进行遗传转化。
　　 2.农杆菌介导叶盘法转化番茄中蔬四号。以番茄无菌苗子叶为外植体，不经愈伤组织阶段，直接诱导分化不定芽。选择Murashige and Skoog medium(MS)为基本培养基，MS+2 mg/L玉米素+维生素C+叶酸为预培养基;MS+2 mg/L玉米素+维生素C+叶酸+乙酰丁香酮为侵染培养基;MS+2 mg/L玉米素+维生素C+叶酸+头孢霉素为洗涤培养基;MS+2 mg/L玉米素+维生素C+叶酸+头孢霉素+潮霉素为筛选培养基。
　　 3.对T0代转基因番茄植株进行潮霉素抗性基因PCR鉴定。共获得牛奶子EutPSY基因超表达番茄阳性转基因株系1个、SlLCY-e沉默株系3个。利用潮霉素引物进行PCR鉴定，检测出预期大小的特异条带。
　　 4.利用cDNA末端快速扩增技术克隆获得牛奶子EutUGP基因的全长。EutUGP基因全长1745bp，包含1个1431 bp的开放阅读框，编码476个氨基酸。EutUGP基因DNA水平全长6221 bp，包含18个内含子。利用染色体步移技术获得EutUGP基因的启动子序列953 bp，其中包含2个蔗糖应答元件等多种顺式作用元件。

目录

论文说明

摘要

缩略词

第一部分 文献综述

第一章 番茄红素的研究

1 番茄红素的合成代谢途径

2 番茄红素的理化性质及生理功能

3 影响番茄红素合成的因素

第二章 牛奶子的研究概况

1 牛奶子类胡萝卜素代谢基因的研究

2 牛奶子果实蛋白组学研究

第三章 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)的研究

1 UGP的定位

2 UGP在植物中的表达模式

3 UGP的作用及研究意义

第四章 本课题研究目的及意义

第二部分 研究内容

第一章 牛奶子EutPSY基因、番茄SILCY-e基因的克隆及载体构建

1 前言

2 材料和方法

3 结果与分析

4．讨论

第二章 番茄的遗传转化研究EutPSY和SILCY-e的生物功能

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

第三章 牛奶子尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(EutUGP)基因全长的克隆与表达分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4．讨论

第四章 EutUGP基因启动子的克隆及初步分析

1 前言

2 材料和方法

3 结果与分析

4 讨论

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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