甘蓝型油菜第七连锁群主效含油量QTL的精细定位和候选基因筛选

摘要

油菜是世界主要的油料作物之一，油菜籽是我国重要的食用油来源，提高油菜籽的含油量就当前最重要的育种目标之一。到目前为止，对油菜含油量QTL定位的研究已有诸多报道，在油菜的所有连锁群中都能检测到与含油量有关的QTL，其中分布在连锁群A1, A3，A4，A6，A7，A8，A10，C2，C3，C4上的QTL在多个环境中检测到，其他连锁群上与含油量有关的QTL只在少数或个别环境中能检测到。但是这些研究目前都还在QTL初级定位的水平上，沿未有对油菜主效含油量QTL进行精细定位的报道。本研究是在前人对含油量QTL进行精细定位的基础上，进一步深度精细定位A7连锁群上主效含油量QTL，并通过生物信息学分析对该QTL区域可能与油脂形成相关的重要候选基因进行筛选。
　　 利用与甘蓝型油菜A7连锁群含油量QTL(OilA7)区域同源的白菜A7连锁群上一个连续的Scaffold序列的信息设计位点特异性标记，对已确定的OilA7区间进行分子标记加密。再通过标记跟踪选择，发展含供体基因组片段的近等基因系分离群体至BC4F2/BC4F3、 BC4F3/BC4F4、 BC5F2/BC5F3和BC6F2/BC6F3世代。利用BC4F2、 BC4F3、BC5F2和BC6F2群体单株进行分子标记的基因型分析和含油量测定，再用相应后代株系BC4F3，BC4F4、BC5F3和BC6F3群体进行二重复的田间试验和含油量测定。含油量通过近红外分析仪测定，每份样品测量三次，取其平均值。
　　 在前期的初定位试验中， OilA7在11个不同环境中被检测到，其LOD值在3.09至20.54之间，对群体的总贡献率为3.59％至24.69％，最终将其定位在21.1cM的区间内。在此基础上，首先用由1147株BC3F1群体的标记基因型和其相应BC3F2株系表现型对该含油量QTL进行确认，将QTL区间缩小至标记ZAAS176和EM4ME8之间，约12.6cM。然后用1300个BC3F2/BC3F3世代和1500个BC4F1/BC4F2世代的单株/株系进行该目标QTL的精细定位，把OilA7区间缩小至528KB，介于标记EST1087和EST1094之间。
　　 本研究在此基础上进行，继续加密分子标记和构建更高世代的近等基因系，对OilA7继续进行深度精细定位。在A7连锁群上的标记EST1017与EST12a之间，共发展位置特异性标记149对，成功定位35对，其中定位于EST1087与EST1094之间的标记有21对。然后利用1861株BC4F2、3280株BC4F3、32株BC5F2和362株BC6F2将OilA7分别缩小至230KB(BC4F2群体)和65KB(BC4F3、BC5F2和BC6F2群体)。在进行BC6F2世代QTL近等基因系间的比对分析时发现，在65KB（介于标记S03-23和S03-6之间）目标区间内含纯合高油等位基因(Gaoyou/Gaoyou)片段(n=47，43.25％)的47个株系平均含油量为43.25％，而含纯合低油等位基因(Sollux/Sollux)片段的47个株系平均含油量41.58％，相差约2个百分点，存在极显著(P=0.000)的差异。经生物信息学比对分析发现在该目标区间内(65KB)存在14个与拟南芥高度同源的ORF，其中一个转录因子，一个DNA重组修复蛋白，一个乙酰辅酶A转移蛋白，一个参与脂质代谢以及一个参与线粒体膜和光合作用等6个ORF有可能是油脂合成有关的候选基因，目前正在进行相关功能分析。

目录

论文说明

摘要

缩写词

1 引言

1．1 研究背景

1．2 研究的目的、意义、内容和目标

2 文献综述

2．1 遗传标记的研究

2．2 常用的分子标记技术

2．2．1 SSR标记

2．2．2 SRAP标记

2．2．3 EST标记

2．2．4 PCR-SSCP标记

2．3 遗传图谱

2．3．1 遗传图谱

2．3．2 遗传作图群体

2．4 QTL定位方法与图位克隆

2．4．1 QTL精细定位

2．4．2 图位克隆

2．5 分子标记辅助选择(Marker Assisted Selection，MAS)

2．6 油菜遗传图谱和含油量QTL定位的研究进展

3 材料和方法

3．1 研究材料

3．2 研究方法

3．2．1 近等基因系的构建

3．2．2 DNA提取和基因型数据的获取

3．2．3 田间试验和表型数据的获取

3．2．4 种子的收获和含油量测定

3．2．5 分子标记的发展和遗传图谱的加密

3．2．6 PCR扩增

3．2．7 电泳和显色

3．2．8 标记基因型的记载

3．2．9 数据分析

4 结果

4．1 A7含油量QTL区间分子标记加密

4．2 QTL-NILs的培育

4．3 利用BC4F2群体对OilA7的精细定位

4．3．1 BC4F2群体标记基因型/含油量表现型的关联分析

4．3．2 BC4F2群体近等基因系间比对分析

4．3．3 BC4F2群体单株/小区标记基因型和含油量表现型关联分析对比

4．4 利用BC4F3、BC5F2和BC6F2群体对A7含油量QTL进行精细定位

4．4．1 BC4F3和BC6F2群体基因型与表现型的关联分析

4．4．2 BC4F3和BC6F2群体近等基因系的对比分析

4．5 生物信息学分析和候选基因筛选

5 讨论

5．1 白菜(Brassica Rapa)基因组序列的释放对甘蓝型油菜OilA7精细定位的意义

5．2 利用近等基因系对QTL精细定位的评价

5．3 OilA7的候选基因预测

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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